专利名称：系统纯化、检测及治疗的制作方法
技术领域：
本发明是利用基因工程使油体蛋白连接专一性肽，并连接上药物肽和/或连接上荧光肽，而组装成油体载体，该油体能包覆药物、已知荧光信号分子或/和细菌，并用在油体载体专一性检测或/和靶向治疗的应用。本发明是利用油体蛋白连接上目标肽的油体体系进行纯化，并得到纯度高目标蛋白，进行各领域的应用。
本发明是利用油体蛋白的抗原油体载体进行动物免疫反应作用，抗原引发免疫反应产生抗体,取出抗体,并组成疫苗。
背景技术：
癌症是目前威胁全球人类生命与健康的主要杀手，根据美国癌症协会统计，2007年全球约有760万人死于各类癌症。根据台湾卫生署统计，2008年全台湾约有38，913人死于恶性肿瘤。在十大主要死因中，恶性肿瘤连续居于首位，而十大主要癌症与死亡率顺位分别为(1)肺癌、⑵肝癌、⑶结肠直肠癌、⑷女性肺癌、(5)胃癌、(6) 口腔癌、(7)摄护腺癌、(8)子宫颈癌、(9)食道癌、(10)胰脏癌。由于癌症的闻发率与复发率,抗肿瘤药物的研发已经受到重视，依据美国药物研究与制造商协会(PhRMA)的数据显示，截至2008年3月31日为止，共有750种癌症治疗药物处于临床试验阶段，等待美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(PhRMA，2008)。传统的癌症治疗方法大致分成下列几种，即外科手术疗法、放射疗法、化学疗法及免疫(基因)疗法。外科手术疗法主要可以直接、快速地移除恶性肿瘤，是最古老、传统且最常用的癌症治疗方式，对于肿瘤生长在身体局部一处时，直接切除方式有很好的治疗效果。若癌细胞扩散，外科手术后遗症是常需要切除肿瘤邻近组织及淋巴组织，常常因为切除过多的组织会造成病人局部功能缺损、障碍，还有手术猝死或弓I起并发症而致死等。放射疗法又称电疗，主要是使用放射线破坏癌细胞，针对癌细胞的方法有两种外在放射疗法及内在放射疗法。外在放射疗法是利用仪器将X光或Y射线释放于肿瘤上而杀死癌细胞。内在放射疗法是将放射物质以颗粒或胶囊方式置入癌症病人体内，对于不适合开刀或不宜切除的组织治疗常会选用此种放射疗法，有时放射疗法也会和外科疗法或化学疗法合并使用，此种方法的后遗症是恶心、呕吐、咳嗽或呼吸困难、吞咽困难、疲倦、掉头发和引发内脏破裂等。化学疗法化学疗法是利用化学物质或激素杀死癌细胞，此方法可以通过口服或注射方式进行治疗，化学疗法可广泛使用在各式肿瘤上。对难以控制及大范围转移或全身性的癌细胞杀死，化学疗法是唯一的、最后的选择，后遗症是全身细胞受到破坏，特别是对免疫淋巴球，治疗时间长，会引起全身细胞的抗药性。免疫疗法免疫疗法是利用病人身体不同的免疫机制作用物质如白介素、肿瘤坏死因子、单克隆抗体及疫苗等来对抗、破坏癌细胞的快速生长。免疫疗法也可以和上述三种常用的癌症治疗方法合并使用井能大幅降低副作用如疲倦、食欲不振、掉发、口腔或皮肤溃烂、恶心及牙齿掉落等大幅降低，并且可在治疗间隔期协助正常细胞慢慢修复，缓慢提升免疫力，并提升癌症的治疗效果，但是治疗时间长，效果也很有限。经过长时间的观察发现，癌细胞表面通常会带有某些特殊分子生物标记在于之前描述特性，这些年来已经发展出靶向治疗方法用于癌症的治疗。靶向治疗方法就是利用实验设计ー种可以专ー性地识别此类生物标记的药物方法，靶向治疗方法可以有效地阻断癌细胞的活化并且能使癌细胞生长受到抑制，而达到治疗目的。靶向治疗药物可以直接且精准地命中目标癌细胞，抑制癌细胞，对体内正常细胞的影响较小，相比于上述治疗方法，靶向治疗具有低毒性、低副作用、高效率、及施行方便等优点，已经引起大家的关注。目前靶向治疗的方法甚多，其ー是利用载体组装、包覆、连结或镶嵌而成的治疗活性的药物分子，并运用各种机制将具有专ー性的活性药物分子递送到目标癌细胞进行作用，此种递送体系称为“药物递送体系”。通常会将载体与可专ー性地识别癌细胞表面生物标记的物质结合，而使此载体具有靶向功能，所述物质可为蛋白质、类固醇、糖类、化合物或 抗体等。载体目前有高分子聚合物颗粒、微胞(micell)、脂质体、及病毒载体等，这些载体也存在不同缺点，如载体粒径过大而不容易被人体吸收、载体容易聚集而不容易被人体吸收、具有毒性而无法排出体外、在血液或体液中不会稳定存在等，在实际运用中也很有限。而且在上述可识别癌细胞的物质与载体结合时，常常需要非常复杂耗时的化学合成步骤，往往会増加制造成本，更会对环境造成污染。所以，在药物递送体系中，也需要非常大的改良空间并改善成粒径微小、无毒性、在血液或体液中稳定、容易结合可识别癌细胞的药物载体体系。油体(Oilbody)油脂在细胞中是储存于ー种称为油体的特有细胞器，而在种子萌芽与幼苗生长时，油体中所储存的油脂便成为其主要能量来源。(Yatsu and Jacks, 1972 ；Stymne andStobart, 1987 ；Huang, 1992)。在花粉及其它较低等的裸子植物种子或蕨类植物的孢子中也有油体的存在(Stanley and Linskens, 1974 ;Ching, 1970 ;Gemmrich, 1981)。依植物种类的不同，油体大小略有差异，将芝麻种子组织超薄切片于电子显微镜下观察时，油体直径大约在O. 2-2 μ m之间(Tzen and Huang, 1992a)。油体在种子组织中，是以互相挤压的形式充满整个细胞，即使经长时间储存，仍然保有其细胞器的完整性(Slack et al.，1980)，这是因为油体表面镶满蛋白质，这些蛋白质提供负电斥力(electricnegative repulsion)及立体障碍来保护油体稳定性(Tzen et al.，1992)。利用投射电子显微镜观察油体表面是由 2_4nm 半单位膜(half-unit membrane)所组成(Yatsu and Jacks, 1972),油体膜的主要成分是脑憐脂(phosphotidyl choline, PC)、卵憐月旨(phosphotidyl ethanolamine,PE)及肌醇憐脂(phosphptidyl inositol, PI) (Donaldson and Beevers, 1977 ；Moreau etal.，1980)。植物种子油体的组成成分大约为97. 5%的中性脂肪(主要为甘油三酯)、1%的磷酯质和I. 5%蛋白质。単一颗种子油体约含十亿个甘油三酯分子、一千万个磷酯质分子、一百万个蛋白质分子(Tzen and Huang, 1992b)。油体是ー团中性脂肪分子被一层类似细胞膜构造成分的磷酯质(phospholipid)所包围，此层磷酯质表面几乎完全镶嵌ー种称为油体膜蛋白(oleosin)的结构蛋白质(具有两种异构型态)以及三种分子量较高的微量蛋白质(Chen et al.，1997)。此三种微量蛋白质依其特性分别命名为油体钙蛋白(油体钙蛋白)(Tzen et al. , 1997)、油体固醇蛋白(steroleosin)与另ー个尚未鉴定完成的蛋白质(Sop3) (Chen et al. , 1999),上述蛋白简称为油体蛋白。油体膜蛋白(Oleosin)由基因序列推测出油体的氨基酸序列发现，油体蛋白质中间的区域有70个左右的疏水性氨基酸，与已知油体主要成分的疏水性甘油三酯有相关性，由此确认其为油体蛋白质的组成成分之一。已经有超过二十种的不同植物油体的油体膜蛋白基因或氨基酸序列被发表，包括油菜(Keddie et al. , 1992)、松子(Lee et al. , 1994)、大麦(Aalen, 1995)、向日葵(Thoyts et al. , 1995)、阿拉伯芥(Zou et al. , 1996 ；Kirik et al·, 1996)、芝麻(Chen et al. , 1997)及水稻(Wu et al. , 1998)等。油体膜蛋白是ー种碱性蛋白质,等电点约在 9-10 之间，其分子量大约在 15-26kDa 之间(Qu etal.，1986 ；Murphy and Au, 1989)。由于油体膜蛋白并不属于水溶性蛋白质，而且也不溶于水，所以目前为止仍无蛋白质结晶能提供X-ray解其立体结构，只能由ー些光谱仪器推測油体膜蛋白的ニ级结构的组成(Li et al.，992)。在比较不同种子的油体膜蛋白氨基酸序列后的结果推測，油体结构主要为N端区域、中间疏水区域及C端区域(Li et al. 992 ;Huang, 1992Herman, 1995)。中间疏水区域连续约70个疏水性氨基酸组成反平行β -链结构而延伸到疏水性的甘油三酯内，经由疏水性作用力将油体膜蛋白稳固地镶嵌在油体上，其中间疏水性区域正中央约有14个氨基酸(TPLFVIFSPILVPA)是不同种类蛋白最不易改变的区域，并形成环状结构以利用蛋白质在空间上回旋,此将其命名为脯氨酸结(Tzen and Huang, 1992) 脯氨酸结的功能仍未知，而有学者推论脯氨酸结会和油体膜蛋白标定至油体表面的机制有密切关联(Abell et al.，1997)。N端及C端两区的结构则平躺于油体表面上，油体膜蛋白是碱性蛋白质而且在满整个油体表面，使油体表面呈负电斥力状态，此外N端及C端使油体能够稳定的存在于种子细胞，且均不会因彼此碰撞挤压而产生融合或聚集的情形，并能达到稳定而长时间保存(Tzenet al. ， 1992 ；Chen et al. ， 1998)。油体钙蛋白(油体钙蛋白):油体钙蛋白(油体钙蛋白)有738个核酸，可转译出245个氨基酸，分子量为27. 6kDa ;结构可分为N端未水区、中间疏水区及C端未水。在N端未水区中，含有Iv能和I丐离子结合的区域(helix-turn-helix calcium binding motif)。中间疏水区可以分成两个子结构域，分别为双性螺旋结构域和锚定区，此固定区含有类似脯氨酸结结构及反平行β -链，而脯氨酸结结构的氨基酸序列进行比对，在不同种油体钙蛋白上也具有高度的相同性，也是通过和甘油三酯间的疏水性作用力，使促油体钙蛋白能稳定的留在油体表面上。而在油体钙蛋白的C端亲水区中，富含几个可能被激活化的部位而产生磷酸化现象，包括酪氨酸激磷酸化位置及酪蛋白激II磷酸化位置。油体钙蛋白与油体膜蛋白所不同的是，油体钙蛋白的N端区及C端区暴露在细胞质中，而并非平躺于油体表面上，油体钙蛋白的功能无法像油体膜蛋白能够保护油体的稳定性及完整性，所以，油体钙蛋白在功能上并不是一个结构蛋白质，而推測油体钙蛋白可能是在种子发芽时參与油体的代谢。本发明是利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接识别病症细胞的专ー性肽，或并接上药物肽或/和再接上荧光肽，而组装成油体载体，该油体同时包覆脂溶性药物(以下简称为包覆药物)、已知荧光信号分子和/或抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)，可以用在油体载体专一性检测或/和靶向治疗。纯化方式非常多，如沉淀法、分子筛层析法、电泳、亲和层析法和共价层析法是已知技术且用于细胞提取物中纯化蛋白质。而且需要表达有关蛋白酶抑制剂当作ー种融合蛋白或嵌合蛋白。融合蛋白技术经常用在蛋白质的纯化过程中，提供ー种"标记"或"操作"。一般而言，以这些体系表达的融合蛋白里面包含亲和标记，例如谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合结构域、聚组氨酸、聚半胱氨酸，蛋白A及链霉亲和素等 等，所述标记共价结合于oleEGFR蛋白质的N-端或C-端。为方便亲和纯化,对此标记具有专ー性的配体被固定于ー个管柱的固态相上。融合蛋白结合至亲和柱，加入过量调整缓冲液(pH值)而冲提出高纯度的融合蛋白。oleEGFR蛋白从标记分子上的分离，以蛋白水解切割于其专一性接头序列。在所使用亲和柱的准备与操作上，虽然比较简便，但是价格非常昂贵，不符合经济效益。抗体固定化免疫亲和技术是利用一种表达的融合蛋白的结合方式，里面含有抗原性的寡肽标记，该标记有运用抗原性前端(antigenic head)部分及连接尾端(linkingtail)部分。该抗原性部分组成是用一些可以快速引发抗原性反应的亲水性氨基酸。而连接区域可以标记在融合蛋白，从细胞分离后再融合蛋白上被切割，而得到该蛋白。使用抗体固定化免疫亲和技术对于纯化技术也很有限。本发明是利用油体膜蛋白或油体钙蛋白接上目标肽的油体体系进行纯化，可以纯化目标蛋白，并得到纯度高的目标蛋白，进行不同领域的应用。

发明内容
本发明是利用油体体系作用，利用基因工程方式将油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专ー性地识别病症细胞的肽(抗体肽、配体肽、专ー性酶肽及穿透肽)，或并接上药物肽(姜黄素、艾利诺得甘、茄红素、β胡萝卜素、脚黄素、虾红素、玉米黄质素、水蛭素、胰岛素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽和/或用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合)，和/或再接上荧光肽，而组装成油体载体，该油体同时包覆药物、包覆已知荧光信号分子和/或抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)，可以用在油体载体专一性检测或/和靶向治疗。本发明是利用油体膜蛋白或油体钙蛋白连接上目标肽的油体体系进行纯化，可以纯化目标蛋白，并得到纯度高的目标蛋白，进行不同领域的应用。


图I、油体载体。图2、药物油体载体。图3、荧光油体载体。图4、荧光油体载体。图5、分离纯化目标蛋白。
图6、抗原油体载体。图7、SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。图8、油体膜蛋白蛋白质和油体钙蛋白的蛋白质组成及自主装油体膜蛋白油体和油体钙蛋白油体试验观察(图示标尺为2微米)。
具体实施例方式本发明是利用油体体系作用，利用基因工程方式将油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专ー性地识别病症细胞的肽(抗体肽、配体肽、专ー性酶肽及穿透肽)，或并接上药物肽(姜黄素、艾利诺得甘、茄红素、β胡萝卜素、脚黄素、虾红素、玉米黄质素、水蛭素、胰岛素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合)，和/或再接上荧光肽，而组装成油体载体，该油体同时包覆药物、包覆已知荧光信号分子和/或抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)，可以用在油体载体专一性检测或/和靶向治疗。
本发明是利用油体膜蛋白或油体钙蛋白接上目标肽的油体体系进行纯化，可以纯化目标蛋白，并得到纯度高的目标蛋白，进行不同领域的应用。除非文中有另外说明，否则本说明书中(尤其是权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含単数及复数形式。
植物种子的油体具有非常大的表面积，可以用在包覆或镶嵌大量的分子，以作为于生物体内移动的实时(real-time)信号放大器来追踪并确认病灶，本发明利用上述特性，再结合分子生物技木，经由简易的制备过程可以提供ー种人造油体(下文简称为油体载体)。本发明利用基因重组技术将油体钙蛋白或油体膜蛋白与识别病症细胞的专ー性肽插入宿主细胞，诱导出油体载体，该油体钙蛋白或油体膜蛋白可以选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合；宿主细胞可以为真核宿主细胞及原核宿主细胞，真核宿主细胞选自以下群组单细胞生物体如酵母细胞、源自高等生物体如植物，昆虫或哺乳动物的不死细胞或其组合，原核宿主细胞选自以下群组杆菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其组合，最佳为大肠杆菌，大肠杆菌当宿主细胞可为E. coli.DH5a、E. coli. BL21 (DE3)、E. coli nissle(AG2)或其组合。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其组成包含一蛋白质，该蛋白质包含一油体钙蛋白或油体膜蛋白及ー识别病症细胞的专ー性肽；一脂质，该脂质加入前述蛋白质后制成油体；以及脂溶性药物，加入前述油体后制成药物油体；通过上述组成，成为具有专ー性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性地识别病症细胞的肽，再加上脂质包覆药物，利用分子生物技术而组装成药物油体，该药物油体同时包覆药物，可以用在药物油体专ー性靶向治疗，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其中，该油体钙蛋白为ー包含由SEQ ID N01所示氨基酸序列的油体钙蛋白。本发明提供作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可利用基因工程并接上药物肽，并组成药物油体载体，该药物肽可以选自于下群组水蛭素(hirudin)、胰岛素、茄红素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合，前述药物油体载体，更可进一歩再包括脂质包覆已知荧光信号分子，加入前述药物油体载体后以分子生物学技术并组装成荧光药物油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点(quantum dot)、异硫氰酸荧光素(FITC)、茜素黄(Alizarine Yellow R)、尼罗红(Nile Red)及其已知能发出不同波长荧光信号知信号分子的组合；油体载体可利用基因工程并接上荧光肽，并组成荧光油体载体，该已知荧光信号分子肽选自以下群组例如GFP、エ业/化学/基因工程组成荧光肽及其荧光肽的组合，其中，荧光油体载体可进ー步再包括脂质包覆药物，加入前述荧光油体载体后以分子生物学技术并组装成荧光药物油体，该药物肽可以选自于下群组水蛭素、胰岛素、茄红素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合；药物油体载体可利用基因工程并接上荧光肽，并组成荧光药物油体载体，该已知荧光信号分子肽选自以下群组例如GFP、エ业/化 学/基因工程组成荧光肽及其荧光肽的组合；上述其一。本发明提供系统纯化、检测及治疗，又另提供了ー种组合，其组成包含一蛋白质，该蛋白质包含一油体钙蛋白或油体膜蛋白及ー识别病症细胞的专ー性肽；一脂质，该脂质加入前述蛋白质后制成油体；以及ー脂溶性已知荧光信号分子，加入前述油体后制成荧光油体；通过上述组成，成为具有专ー性传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，再加上脂质包覆药物，利用分子生物技术而组装成药物油体，该药物油体同时包覆脂溶性已知荧光信号分子，可以用在荧光油体专ー性检测，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其中该已知荧光信号分子选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素(FITC)、茜素黄(Alizarine Yellow R)、尼罗红(Nile Red)及其已知能发出不同波长荧光信号知信号分子。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其中，该蛋白质可先接上专ー性接头组合成专一性接头的蛋白质，该油体白质包含一油体钙蛋白或油体膜蛋白、一专ー性接头及ー识别病症细胞的专ー性肽；一脂质，该脂质加入前述蛋白质后制成专ー性接头油体；再利用专一性蛋白酶水解切割，可纯化出纯度高的蛋白质的应用，该方法简单又方便并不会影响蛋白的性质。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其中，该油体钙蛋白可为植物种子的油体钙蛋白或油体膜蛋白，其选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合。本发明通过作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，该油体膜蛋白为包括由SEQ ID NO 1所示氨基酸序列及SEQ ID NO 3所示DNA序列的油体膜蛋白，和/或该油体I丐蛋白为包括由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列及SEQ ID NO 4所示DNA序列的油体I丐蛋白。本发明组装药物油体及荧光药物油体的药物或药物肽的药物，能具有抑制病症细胞、毒杀病症细胞、插入/改变/去除一个或多个基因使病症细胞基因突变而无法正常或快速分裂引发病症细胞萎缩或自我凋亡、使病症细胞制成步骤中断而无法进行细胞周期的分裂、在病症细胞内产生抑制或破坏病症细胞生长条件的物质而无法进行细胞周期的分裂及使病症细胞无法感染正常细胞的物质都能与该油体进行组装或结合，具有专一性识别癌化部位抑制及药物治疗的效果。本发明提供系统纯化、检测及治疗，其中，该脂质选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合。值得说明的是，本发明提供作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，采用的宿主细胞E. coli nissle ( A G2)为一种益生菌的大肠杆菌，并对糖尿病、胃部疾病、心脏病或其 疾病有治疗效果。实施例I本发明的油体载体包含有一融合蛋白质及一脂质，其中，该融合蛋白质包含一油体蛋白(油体膜蛋白、油体钙蛋白及油体固醇蛋白)、一配体肽、一抗体肽、一细胞穿透肽、专一性酶肽、一类固醇、一糖类、一化合物或其组合(以上一配体肽、一抗体肽、一细胞穿透肽、专一性酶肽、一类固醇、一糖类或一化合物简称为识别病症细胞的专一性肽，又称为专一I"生肽)。本发明油体载体中的融合蛋白质，其所包含的油体蛋白并无任何限制。但是，该油体蛋白是属于植物种子的油体蛋白，例如选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、葵花、芥花、亚麻、红花(safflower)、或其组合；最佳是,该油体蛋白选自于芝麻种子的油体蛋白。于本发明的一个方面，使用芝麻种子的油体膜蛋白来构建融合蛋白质，其包含由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或者，使用芝麻种子的油体钙蛋白来构建融合蛋白质，其包含由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明油体载体的融合蛋白质，另外还包含识别病症细胞的专一性肽,使油体载体成主动靶向药物递送体系。由于识别病症细胞的专一性肽可精准地识别病症细胞表面的受体。因此，透过药物油体载体或是以之荧光分子与受体的结合，可将包覆有抗病症药物、以之荧光分子和/或抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)的油体载体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度或检测，而不致影响正常细胞。此外，通过上述机制，亦可刺激癌细胞对油体载体的吞噬作用与融合作用，使抗病症药物、已知荧光信号分子和/或抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)进入细胞，达到检测、治疗及避免产生抗药性的目的。本发明荧光油体载体包含有一融合蛋白质、一荧光肽及一脂质。其中，该荧光肽(例如GFP、化学或基因工程组成荧光肽及其荧光肽)能激发出荧光信号并更容易观察，荧光油体载体能专一性检测且识别病症细胞表面的受体。因此，透过识别病症细胞的专一性肽与受体的结合，可镶嵌有荧光信号的油体载体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的检测，而不致影响正常细胞。此外，通过上述机制，并可刺激癌细胞对荧光油体载体的吞噬作用与融合作用，使荧光油体载体进入癌细胞，达到靶向检测的目的。本发明药物油体载体包含有一融合蛋白质、一药物肽及一脂质。其中，该药物肽即是抑制病症的肽、使病症细胞自我凋亡的肽、用分子生物学组成的抗病症药物肽和/或其组合肽，该药物肽组装成一具有药物功能的蛋白。该药物油体载体能专一性识别病症细胞表面的受体。因此，透过药物油体载体与受体的结合，药物油体载体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞。此外，通过上述机制，亦可刺激癌细胞对油体载体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，达到治疗及避免产生抗药性的目的。本发明油体载体中的脂质并无任何限制，该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、葵花油、玉米油或其组合；最佳的脂质为甘油三酯、芝麻油、或其组合，更佳为芝麻油。本发明的油体载体包覆药物可以包含任何药物或是抑制/毒杀/让病症细胞自我凋亡的物质，并不限于抗癌药物，且较佳是含有脂溶性药物。举例言之，可于本发明组合中含有选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平(商品名为Navelbin)、紫杉醇(Paclitaxel)、西药、中草药或其组合。本发明是利用茄红素、姜黄素及喜树碱进行组装油体载体。本发明的组合亦可包含任何已知的信号分子，以达成所要的检测目的。举例言之， 该信号分子可选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红、或其组合。就铯化镉量子点的应用而言，由于以不同波长的光来激发不同尺寸的铯化镉量子点时，会散射出不同波长的荧光，故可藉此特性来制备发射不同荧光颜色的油体载体。于此，当使用识别病症细胞的专一性肽来构建本发明组合中所包含的融合蛋白质时，可使本发明组合具有靶向检测的功能，以用于标定癌细胞或病症的位置。本发明利用基因重组技术将一油体膜蛋白或油体钙蛋白、一识别病症细胞的专一性肽、一药物肽和/或荧光肽，利用上述肽制成重组载体、重组荧光载体及重组药物载体，实施方式如案例I所示及图I所示，并得到融合蛋白的表达载体。实施方式如案例2所示及图2所示，并得到药物融合蛋白的表达载体(下文简称为药物油体载体)。实施方式如案例3所示及图3所示，并得到荧光融合蛋白的表达载体(下文简称为荧光油体载体)。实施方式如案例4所示及图4所示，并得到荧光药物融合蛋白的表达载体(下文简称为药物荧光油体载体)。完成构建上述表达载体后，分别将其转化至大肠杆菌宿主细胞，并提取质粒以确认表达载体的核苷酸序列。利用诱导剂(例如IPTG)诱导步骤一中所制得的宿主细胞，使其大量表达融合蛋白，并收集菌液。以6，500转/分钟的转速使菌液离心10分钟，再以约1/10倍的菌液体积的TE缓冲液(TE(Tris-EDTA)buffer)悬浮经离心沉淀的宿主细胞，将制得的融合蛋白质(50毫克)加入至一试管中，并添加50毫克脂质、脂质包覆抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)、脂质包覆药物或脂质包覆已知荧光分子，再利用超声(型号=Sonics VCX130)样品处理器以5分钟的间隔震荡五次(条件为10秒，20amplitude，0. 5pulser)，以进行油体重组。得到油体载体、药物油体载体、荧光油体载体、细菌油体载体、药物荧光油体载体、细菌药物油体载体、细菌荧光油体载体及细菌药物荧光油体载体。并利用上述油体载体的组合具有靶向检测的功能，以用于标定癌细胞或病灶的位置，也可准确地传递药物，故可精准地杀死癌细胞以减少正常细胞被杀死的副作用，因而具有实时性地监控与治疗的功效。表I油体粒径
权利要求
1.一种作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其组成包含 油体载体，其是以利用基因重组技术将油体钙蛋白或油体膜蛋白与识别病症细胞的专一性肽插入宿主细胞所诱导出，该油体钙蛋白或油体膜蛋白可为植物种子的油体钙蛋白或油体膜蛋白，上述油体钙蛋白或油体膜蛋白可以选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合；该专一性肽可以选自以下群组的肽配体肽、抗体肽、细胞穿透肽、专一性酶肽、类固醇、糖类、或其组合，前述宿主细胞可以为真核宿主细胞及原核宿主细胞，真核宿主细胞选自以下群组单细胞生物体如酵母细胞、源自高等生物体如植物，昆虫或哺乳动物的不死细胞或其组合，原核宿主细胞选自以下群组杆菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其组合，最佳为大肠杆菌，大肠杆菌当宿主细胞可为E. coli.DH5a、E. coli. BL21 (DE3)、E. coli nissle ( A G2)或其组合；以及 脂质，其加入前述蛋白质后制成油体载体，该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋 白连接专一性识别病症细胞的肽，可精准的识别癌细胞表而的受体。
2.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可进一步包括脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术并组装成荧光油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，并加入脂质包覆已知荧光信号分子，利用分子生物技术而组装成荧光油体，可以用在专一性靶向检测，而不致影响正常细胞，以达到病症部位专一性靶向检测的目的。
3.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可进一步包括脂质包覆药物，以分子生物学技术并组装成药物油体，该药物选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，并加入脂质包覆已知荧光信号分子和脂质包覆药物，利用分子生物技术而组装成荧光药物油体，可以用在专一性靶向治疗及检测，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。
4.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可再包括脂质包覆药物和脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术并组装成荧光药物油体，该药物选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合；该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，并加入脂质包覆已知荧光信号分子和脂质包覆药物，利用分子生物技术而组装成荧光药物油体，可以用在专一性靶向治疗及检测，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。
5.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可利用基因工程并接上药物肽，并组成药物油体载体，该药物肽可以选自于下群组水蛭素、胰岛素、茄红素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合，前述药物油体载体，更可进一步再包括脂质包覆已知荧光信号分子，加入前述药物油体载体后以分子生物学技术并组装成荧光药物油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红及其已知能发出不同波长荧光信号知信号分子的组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基 因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接药物肽，再接上药物肽，并加入脂质，利用分子生物 技术而组装成药物油体，可以用在专一性靶向治疗，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。
6.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可利用基因工程并接上荧光肽，并组成荧光油体载体，该已知荧光信号分子肽选自以下群组例如GFP、工业/化学/基因工程组成荧光肽及其荧光肽的组合，其中，荧光油体载体，可进一步再包括脂质包覆药物，加入前述荧光油体载体后以分子生物学技术并组装成荧光药物油体，该药物肽可以选自于下群组水蛭素、胰岛素、茄红素、抑制病症的蛋白质、引发病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，再接上荧光肽，并加入脂质，利用分子生物技术而组装成荧光油体，可以用在专一性靶向检测，而不致影响正常细胞，以达到病症部位专一性靶向检测的目的。
7.如权利要求5所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，药物油体载体可利用基因工程并接上荧光肽，并组成荧光药物油体载体，该已知荧光信号分子肽选自以下群组例如GFP、工业/化学/基因工程组成荧光肽及其荧光肽的组合； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，再接上药物肽及荧光肽，利用分子生物技术而组装成药物油体或荧光药物油体，可以用在专一性靶向治疗及检测，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。
8.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体载体可进一步包括抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)，以分子生物学技术并组装成包覆细菌的油体； 通过上述组成，成为具有专一性的传递载体，以提供一主动靶向药物递送体系，利用基因工程使油体膜蛋白或油体钙蛋白连接专一性识别病症细胞的肽，再加上脂质及抑制或毒杀病症细胞的细菌(乳酸菌)，利用分子生物技术而组装成油体，可以用在油体专一性靶向治疗，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对油体的抑制作用与自我凋亡，使油体进入病症细胞，以达到治疗的目的。
9.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体钙蛋白或油体膜蛋白利用基因工程技术接上抗原蛋白或抗原肽，加入前述蛋白后以分子生物学技术并组装成抗原油体，抗原蛋白并无任何限制，该蛋白可以引发免疫反应产生抗体制造出动物疫苗口服疫苗的抗原(例如小儿麻痹、口服轮状病毒或其组合)、注射疫苗的抗原(例如流行性感冒、日本脑炎、A型肝炎、狂犬病或其组合)、免疫疫苗的抗原(例如A型或B型肝炎、德国麻疹、水痘、狂犬病、破伤风或其组合)或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的抗原载体，利用基因工程组成抗原油体载体，并加入脂质，利用分子生物技术而组装成抗原油体，打入动物体内，具有携带抗原引发免疫反应产生抗体的能力，而制造出动物疫苗。
10.如权利要求I至9所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其 中，该油体膜蛋白为包括由SEQ ID NO 1所列的氨基酸序列及SEQ ID NO 3所列的DNA序列的油体膜蛋白，和/或该油体钙蛋白为包括由SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列及SEQ IDNO 4所列的DNA序列的油体钙蛋白。
11.如权利要求I至9所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，该蛋白质可先接上专一性接头组合成专一性接头的蛋白质，该专一性接头的蛋白质包括一油体钙蛋白或油体膜蛋白、专一性接头及目标肽；脂质，该脂质加入前述蛋白质后制成专一性接头油体；再利用专一性蛋白酶水解切割，可纯化出纯度高的蛋白质的应用，该方法简单又方便并不会影响蛋白的性质，其中，目标肽分离纯化目标油体载体的目标蛋白肽，该肽可以选自于下群组药用蛋白水蛭素、胰岛素、茄红素、表皮生长因子、载脂蛋白Al、载脂蛋白B或其组合。工业用酶3 -葡萄糖酸苷酶、木聚糖酶、凝乳酶、葡萄糖异构酶、磷酸异构酶、胶原蛋白水解酶或其组合。动物饲料添加剂植酸酶或其组合。具有营养价值的外源蛋白二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、a-次亚麻油酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸、Y-次亚麻油酸或其组合，生质能源酒精、柴油、纤维素、葡萄糖或其组合；该油体蛋白可为植物种子的油体钙蛋白或油体膜蛋白，上述油体蛋白可以选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合；该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合。
12.如权利要求I至9所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，所组装药物油体及荧光药物油体的药物或药物肽的药物，能具有抑制病症细胞、毒杀病症细胞、插入/改变/去除一个或多个基因使病症细胞基因突变而无法正常或快速分裂引发病症细胞萎缩或自我凋亡、使病症细胞制成步骤中断而无法进行正常细胞周期的分裂、在病症细胞内产生抑制或破坏病症细胞生长条件的物质而无法进行细胞周期的分裂及使病症细胞无法感染正常细胞的物质都能与该油体进行组装或结合，具有专一性识别癌化部位抑制及药物治疗的效果。
全文摘要
本发明是利用基因工程组装成油体载体，可以用在油体载体专一性检测并同时靶向治疗；结合油体膜蛋白或油体钙蛋白成为油体载体系统进行纯化，能更快速且更经济得到目标蛋白。本发明是利用油体膜蛋白或油体钙蛋白的抗原油体载体进行动物免疫反应作用，而得到疫苗。
文档编号A61K47/42GK102743761SQ20111032710
公开日2012年10月24日 申请日期2011年10月25日 优先权日2010年12月21日
发明者朱宝美, 陈顺基 申请人:陈致融