专利名称：一种治疗仔猪白痢的中药复方连翁止痢颗粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于兽药领域，涉及一种治疗仔猪白痢的中药复方制剂，具体来说，涉及一种连翁止痢颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
仔猪白痢为仔猪外感暑湿之邪，湿热郁结肠内，胃肠气血阻滞，正气与暑湿热毒相搏，肠道粘膜及肠壁脉络受损，化为脓血而导致的湿热痢，因此当以清热燥湿，凉血解毒止痢之法进行治疗，邪毒被祛，则诸证可解。现代药理学研究表明，黄连、白头翁、老鹳草和大黄炭的具有抗炎、抗菌和调节免疫功能的作用。仔猪白痢是由大肠杆菌感染导致的腹泻，该病的发生除与大肠杆菌在肠道内定居和产生肠毒素的作用有关外，还与由于年龄、免疫状态、生理机能、饲养条件等多种诱因造成的消化机能紊乱有关。在各种不利因素的影响下，仔猪消化道内食物分解不全的产物或由于发酵产生的低级脂肪酸，刺激肠蠕动加快而引起泻下。病猪消化机能紊乱使肠道菌群失调，有害细菌大量繁殖，产生更多的有毒产物，如细菌内毒素和肠毒素。这些有毒产物及食物分解不全的产物刺激肠粘膜发生炎症过程，可促进液体从肠壁向肠腔渗出，力口重了泻下。食糜中的大量脂肪酸被向后推移，与大肠腔内的碱性离子(钠、钙、钾、镁)结合，成为白色脂肪酸皂化物而使粪便变成灰白色，在临床上即表现为白痢。现有中药技术在治疗仔猪白痢方面缺乏系统性，有些因疗效不确切而中断使用，有些使用价格昂贵的药物，本发明在现有技术的基础上，将上述中药合用，制备成一种称之为“连翁止痢颗粒”的纯中药制剂，各药材相互配合，发挥协同增效作用，使用方便、作用机理明确、毒副作用小、治疗仔猪白痢不影响人类健康。本发明的连翁止痢颗粒的制备方法包括药材的浸润、提取、浓缩、制粒等步骤，本发明可以有效的提闻有效成分的提取得率，提闻生物利用度，减少有效成分的损失，该制备方法适合于连翁止痢颗粒的工业化生产。颗粒剂有利于猪的消化、吸收，大大提高了药物的生物利用度，既节约了中药资源，又可适当提高药效。连翁止痢颗粒在使用时采用拌料饲喂，也可混水灌服，使用方便的特性有利于该药的推广应用。临床试验结果显示，本发明的连翁止痢颗粒用于治疗仔猪白痢效果良好。其用法用量为一次量，每Ikg体重，仔猪0. 25g，一日2次，连用3日。

发明内容
本发明提供由黄连、白头翁、大黄炭、老鹳草四味中药经粉碎加工制备而成的颗粒齐U，具有清热燥湿，解毒止痢的功效。方用味苦性寒之黄连为君，清热燥湿，解毒止痢；白头翁为臣，助黄连止痢；老鹳草大为佐，使黄连、白头翁解毒止痢倍增；黄炭为使，既可协君药黄连解毒，又能取其炒炭之收敛功效以助君臣止泻；四味相配，互相协同，优势互补，共收清热燥湿，解毒止痢之功。
本发明提供了一种连翁止痢颗粒及其制备方法和应用，本发明所用的连翁止痢颗粒使用方便、作用机理明确、毒副作用小、治疗仔猪白痢不影响人类健康。颗粒剂是由中药经浸润、提取、浓缩、制粒制成的，此剂型口服给药，应用方便。而且经提取、浓缩后，药物的有效成分容易释放，显效较快。将中药提取、浓缩制成颗粒后，运输方便，同时提高了制剂的稳定性，便于保存。颗粒剂的生产工艺相对简单，易操作，对生产机械无特殊要求，易生产。因此，该处方制成颗粒剂，通过实验所选剂型工艺亦可 行，便于生产、使用、贮存和运输。本发明采用下述技术方案予以实现。一种治疗仔猪白痢的中药颗粒剂，由以下重量配比的中药原料药制备而成黄连100-300g,白头翁100-300g，老鹳草100-300g，大黄炭100_300g。优选的由以下重量配比的中药原料药制备而成黄连200g，白头翁200g，老鹳草200g，大黄炭200g。本发明还包括，本发明的颗粒剂的制备方法，该方法包括将白头翁、黄连、老鹳草进行提取、浓缩、然后加入大黄炭进行制粒的步骤。其中，所述提取采用乙醇回流提取。优选的所述提取包括以下步骤( I)黄连、白头翁、老鹳草加入10倍量50%乙醇浸润30分钟都可使药材浸润透。(2)回流提取三次，每次I小时,每次加入10倍量50%乙醇。(3)回收乙醇后对提取液合并浓缩，浓缩到浓缩液相对密度I. 25 (60°C)。(4)提取液减压浓缩至相对密度为1.25 (60°C)的稠膏，加入大黄炭粉，混匀，干燥，粉碎，得到药物活性成分。其中，所述制粒包括以下步骤药物活性成分加入辅料，混匀，加入乙醇润湿，制粒，烘干，整粒，制成。优选的本发明的制备方法，包括以下步骤(I)黄连、白头翁、老鹳草加入10倍重量的50%乙醇浸润30分钟使药材浸润透。(2)回流提取三次，每次I小时，每次加入10倍重量的50%乙醇。(3)回收乙醇后对提取液浓缩，浓缩程度到浓缩液相对密度I. 25 (60°C)。(4)提取液减压浓缩至相对密度为I. 25(60°C)的稠膏，加入大黄炭粉，混匀，干燥，粉碎，加入适量辅料(蔗糖糊精=2:1)，混匀，70%乙醇润湿，制粒，烘干，整粒，制成1000g。其中辅料加入量以使成品达到IOOOg为准。本发明还包括本发明颗粒剂的检测方法，包括黄连的薄层鉴别，大黄炭的薄层鉴另IJ，白头翁药材的薄层鉴别，白头翁皂苷B4的薄层鉴别。其中黄连的薄层鉴别，步骤如下 (I)供试品溶液的制备取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加热回流15分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇IOml溶解，作为供试品溶液。( 2 )对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。(3)对照药材溶液的制备
取黄连对照药材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成对照药材溶液。(4)阴性对照溶液的制备取缺黄连阴性对照品0. 3g,同法制成阴性对照溶液。(5)薄层鉴别以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，硅胶G薄层板，点样量liU，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。其中，大黄的薄层鉴别，步骤如下( I)供试品溶液的制备取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小时，滤过，蒸干，残渣加水IOOml使溶解， 再加盐酸10ml，加热回流30分钟(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振摇提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。( 2)对照药材溶液的制备取大黄对照药材0. Ig,同法制成对照药材溶液。(3)阴性对照溶液的制备称取按处方制备工艺制备缺失大黄炭阴性对照品0. 26g，同法制成阴性对照溶液。(4)薄层鉴别以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上层溶液为展开剂，羧酸甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板，点样量4 yl，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。其中，白头翁药材的薄层鉴别，步骤如下取本品3g，加石油醚30ml，超声提取20分钟，滤过。残渣加70%乙醇超声提取两次，每次加70%乙醇30ml，提取时间20分钟。滤过，合并提取液，浓缩，用70%乙醇定容至10ml，作为供试品溶液。另取白头翁药材lg，同法制备对照药材溶液。取缺失白头翁的阴性对照样品2g，同法制备阴性对照溶液。以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，点样量2 iil，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。其中，白头翁皂苷B4的薄层鉴别，步骤如下取本品3g，加石油醚10ml，超声提取20分钟，滤过，残渣加70%乙醇超声提取两次，每次30ml，提取20分钟。滤过，合并提取液，滤液蒸干，残渣加甲醇IOml使溶解，作为供试品溶液。再取缺失白头翁的阴性对照样品3g，同法制成阴性(同时按处方量制成的缺失白头翁样品)对照溶液；取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热至斑点显色清晰。本发明颗粒剂的使用方法如下按2g/kg/d以下剂量连续拌饲给药5d,对仔猪无毒副作用；按体重0. 5g/kg/d剂量，分2次拌饲给药3d，能有效治疗仔猪白痢病。本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下
2. I黄连的薄层鉴别( I)供试品溶液的制备取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加热回流15分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇IOml溶解，作为供试品溶液。( 2)对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。(3)对照药材溶液的制备取黄连对照药材粉末0. 05g,加甲醇IOml,同法制成对照药材溶液。

(4)阴性对照溶液的制备取缺黄连阴性对照品0. 3g,同法制成阴性对照溶液。(5)薄层鉴别试验参照2005版兽药典方法，制成供试品、对照品、对照药材及阴性对照品溶液。试验主要进行黄连薄层鉴别条件优化包括展开剂、点样量、预饱和时间、薄层板等因素对色谱分离的影响。a展开剂的考察以硅胶G板，点样量2iU，分别用以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水(6:3:1.5:1. 5:0. 3)和正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2) [2]作为展开剂展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，斑点清晰集中，确定正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂。b点样量的考察以硅胶G板，分别点样2 ill和I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开齐U，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。IiU的点样量，分离度更好，确定点样量Iu I。c饱和时间的考察以硅胶G板，点样I iU，以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。分别考察了展开剂预饱和时间0分钟、10分钟对色谱图的影响。结果表明，展开剂预饱和时间为0分钟和20分钟对色谱分离无明显影响。确定展开剂无需预饱和。d薄层板的考察以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，点样量liU，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。对不同薄层板(G板、GF254板)进行了考察，结果色谱行为差异不大。参照药典选择薄层G板。(6)小结通过薄层色谱(不同展开剂、不同点样量、不同的预饱和时间、不同薄层板)优化，采用色谱条件以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，硅胶G薄层板，点样量liU，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。该鉴别方法简便快速，重现性好，专属性强，收入质量标准正文。2. 2大黄的薄层鉴别
( I)供试品溶液的制备取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小时，滤过，蒸干，残渣加水IOOml使溶解，再加盐酸10ml，加热回流30分钟(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振摇提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。(2)对照药材溶液的制备取大黄对照药材0. Ig,同法制成对照药材溶液。
(3)阴性对照溶液的制备称取按处方制备工艺制备缺失大黄炭阴性对照品0. 26g,同法制成阴性对照溶液。(4)薄层鉴别试验参照2005版兽药典[3]中大黄药材的薄层鉴别方法，以石油醚(30_60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 :1)的上层溶液为展开剂，主要考察了不同点样量、不同预饱和时间、不同薄层板、不同展距对色谱分离的影响。a点样量的考察以硅胶G薄层板，分别点样2 ill和4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，分别置紫外光灯(365nm)下及氨蒸气中熏后日光下检视。结果2iU的点样量，斑点不清晰，确定点样量4iU。b饱和时间的考察以硅胶G薄层板，点样量4 iil，以石油醚(30-60°C)_甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上层溶液为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，分别置紫外光灯(365nm)下及氨蒸气中熏后日光下检视。分别考察了展开剂预饱和时间0分钟和10分钟对色谱分离效果的影响。结果表明，展开剂预饱和时间为Omin和IOmin对色谱分离无显著差异。确定展开无需预饱和。c薄层板的考察以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上层溶液为展开剂，点样量4 Ul，展开，展距5cm，展毕，分别置紫外光灯(365nm)下及氨蒸气中熏后日光下检视。对不同薄层板(G板、GF254板、H板)进行了考察，结果表明，硅胶H板展开斑点成点性更好，确定选择薄层H板。d展距的选择以石油醚(30_60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 :5 :1)的上层溶液为展开剂，羧酸甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板，点样量4iU，展开，展距分别为5cm和10cm，取出，晾干，分别置紫外光灯(365nm)下及氨蒸气中熏后日光下检视。展距IOcm时分离效果更好，确定展距10cm。(5)小结通过薄层色谱条件(不同点样量、不同预饱和时间、不同薄层板、不同展距)优化，采用色谱条件以石油醚(30-60°C)-甲酸乙酯-甲酸(15 5 1)的上层溶液为展开剂，羧酸甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板，点样量4 yl，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，阴性对照无干扰。该鉴别方法简便快速，重现性好，专属性强，收入质量标准正文。
2. 3白头翁药材的薄层鉴别(I)方法一取本品0. 3g，加入70%乙醇10ml，振摇20min，过滤，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取对照药材粉末O.lg，同法制成供试品溶液。取缺失白头翁的颗粒剂0. 2g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各Iu 1，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(70 30 10)10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，展距5cm,取出，晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热5 10分钟，日光下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，本品无相对应的斑点。(2)方法二 取本品1.5g，加水10ml，加盐酸4ml，回流提取lh，过滤，滤液浓缩至5ml，用50ml氯仿萃取一次，氯仿提取液浓缩至5ml，制得供试品溶液。另取白头翁药材0. 5g，同法制成对照药材溶液；取缺失白头翁的阴性对照品lg，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法，分别吸取供试品溶液、对照品药材溶液和阴性对照溶液各I U 1，点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，本品无相对应的斑点。(3)方法三取本品3g，加石油醚30ml，超声提取20分钟，滤过。残渣加70%乙醇超声提取两次，每次加70%乙醇30ml，提取时间20分钟。滤过，合并提取液，浓缩，用70%乙醇定容至10ml，作为供试品溶液。另取白头翁药材lg，同法制备对照药材溶液。取缺失白头翁的阴性对照样品2g，同法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法，分别吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液各Iu 1，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(65 35 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的褐色斑点，阴性对照样品无干扰。确定方法三为供试品溶液制备制备方法。(4)薄层鉴别实验照方法三，分别制备供试品、对照品及阴性对照品溶液，进一步优化白头翁薄层鉴条件，主要考察了不同展开剂、不同点样量、不同饱和时间、不同薄层板、检视方法对检出效果的影响。a展开剂的考察以硅胶G 板，点样 I iil，分别用氯仿-甲醇-水(60:40:10 ；65:35:10 ； 55:45:10)和正丁醇-醋酸乙酯-水(4:1:5)作为展开剂,展开,展距5cm,取出，晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果氯仿-甲醇-水(60:40:10)展开效果最佳，斑点清晰，Rf值大小适宜。确定氯仿-甲醇-水(60:40:10)作为展开剂。b点样量的考察以硅胶G板，分别点样I ill和2 iil，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果1 Ul点样量，斑点不清晰且拖尾。确定点样量为2iU。c饱和时间的考察
以硅胶G板，点样2 yl，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，展距5cm,取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。分别考察了预饱和时间0分钟和20分钟对色谱分离效果的影响。结果展开剂预饱和时间为0分钟和20分钟对色谱分离效果无显著影响。确定展开无需预饱和。d薄层板及检视方法的考察以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，点样量2 Ul，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。对不同薄层板(G板、GF254板、H板)进行了考察。结果薄层板的类型对白头翁的薄层分离效果影响不大，且在紫外下均无特征斑点，但硅胶G板和GF254板成点性较好，考虑到硅胶G板较通用，确定选择硅胶G薄层板在日光下检视。 (5)小结通过供试品溶液制备方法、薄层色谱条件(不同展开剂、不同点样量、不同预饱和时间、不同检视方法)优化，采用色谱条件以氯仿-甲醇-水￠0 40 10)10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，点样量2 yl，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。该鉴别方法简便快速，重现性好，专属性强，收入质量标准正文。2. 4白头翁皂苷B4的薄层鉴别取本品3g，加石油醚10ml，超声提取20分钟，滤过，残渣加70%乙醇超声提取两次，每次30ml，提取20分钟。滤过，合并提取液，滤液蒸干，残渣加甲醇IOml使溶解，作为供试品溶液。再取缺失白头翁的阴性对照样品3g，同法制成阴性(同时按处方量制成的缺失白头翁样品)对照溶液；取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国兽药典》2010年版二部，附录32页)试验，吸取上述两种溶液各2 yl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(60 40 10)10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结论通过供试品溶液制备方法、薄层色谱条件优化，采用色谱条件以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显一个相同颜色的主斑点，阴性对照无干扰。该鉴别方法简便快速，重现性好，专属性强。通过参照药典与文献方法，分别进行了有效成分白头翁皂苷B4和白头翁对照药材的检出研究，结果两种方法均能有效检出药物中的白头翁。但因目前市场上无法购得中国药品生物制品检定所生产的白头翁对照药材，因为选用白头翁皂苷B4对照品进行白头翁的薄层鉴别，该方法专属性很好，没有干扰，所以选择以白头翁皂苷B4作为对照来检出复方的白头翁，将白头翁皂苷B4薄层鉴别的方法收入质量标准正文。2. 5老鹳草的薄层鉴别( I)供试品溶液的制备取复方4. 5g，加甲醇45ml，水浴回流30分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇16ml溶解，作为供试品溶液。(2)对照药材溶液的制备取老鹳草对照药材lg，同法制成对照药材溶液。 (3)阴性对照溶液的制备取缺失老鹳草阴性样品3. 5g，同法制成阴性对照溶液。(4)薄层鉴别实验照薄层色谱法实验，主要考察了不同展开剂、不同显色剂对色谱分离的影响。a展开剂的考察以硅胶G薄层板上，点样量2iU，分别以氯仿-甲醇(10:1)，石油醚-丙酮(5:1)，石油醚-丙酮(2:1),甲苯-氯仿-丙酮(40:25:35)作为展开剂,展开，展距5cm,取出，晾干，置紫外365nm下检视。在各展开条件下，对照药材均无明显斑点。b显色剂的考察以硅胶G薄层板上，点样量2 U 1，石油醚-丙酮(2:1)为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，分别以10%硫酸乙醇、茴香醛显色，日光下检视，对照药材无明显斑点。(5)小结在不同展开体系和不同显色剂条件下，对照药材均无明显斑点，不能从本品中有效检出老鹳草药材，老鹳草药材的薄层鉴别方法尚待于进一步研究，暂不列入本品质量标准。本发明的中药颗粒剂是经过实验筛选获得的，药效学实验数据如下以本发明实施例2所得连翁止痢颗粒对大肠杆菌感染导致的仔猪白痢的临床防治效果试验本试验选择患有腹泻，排乳白或灰白色浆糊状腥臭粪便，尾根腹侧、肛门周围粘有粪便等典型仔猪白痢临床症状的扬州江都宝龙猪场的大约梅三元杂交瘦肉仔猪为初选对象，无菌采集8头疑似仔猪白痢患猪的肛门棉拭子和2头病死猪发炎小肠粘膜病料，按细菌学经典检验方法，经分离培养、形态观察、染色反应、生化试验和抗原血清型凝集试验等鉴定证实，其病原主要是08:F4、0138:F4血清型的致病性大肠杆菌，据此确诊该猪场仔猪所患疾病为致病性大肠杆菌引起的仔猪白痢病。选择该猪场同日龄健康仔猪作为药物耐受性试验的实验动物。通过选择25 35日龄健康断奶仔猪65头作连翁止痢颗粒耐受性试验，150头患白痢断奶仔猪作实验性疗效试验和80头25 40日龄患白痢断奶仔猪作扩大临床疗效试验。具体方法如下由于引发仔猪白痢的因素很多，在试验分组的设计过程中，应充分考虑天气、环境、母猪等因素对试验结果的影响，从而确保试验尽可能在相同条件下进行，以减少试验误差，达到客观评价药物疗效的目标。因此，整个试验采用同窝对照试验原则，力求减少主、客观因素对实验结果的影响。试验期间，试验仔猪给予不添加任何抗菌素的全价饲料，按常规
饲养管理饲养。
I药物耐受性试验选取25 35日龄、体重5 6. 5kg的临床健康断奶仔65头，逐头称重、编打耳号后，随机分为3组，参照中华人民共和国兽药典和大鼠急性毒性试验结果[5]，其中2个给药组各20头仔猪，分别按连翁止痢颗粒2g/Kg/d、lg/Kg/d的剂量分2次拌饲内服，I个空白对照组25头仔猪，给予相应量的医用淀粉，连续给药5d。给药后每天观察，仔细记录各头仔猪的采食、饮水、排便和毒性反应出现的时间、死亡情况，连续观察10d。观察期内自由采食和饮水。观察期结束后分别称重，统计各组的日均增重，最后各组处死2头存活仔猪，进行眼观病理学检查。2实验性疗效试验选择该场25 35日龄、体重为5飞.5kg的自然患白痢断奶仔猪150头，经确认仔猪未用过任何药物治疗后，逐头编打耳号、称重后，将同窝仔猪随机分为5组即连翁止痢颗粒高、中、低剂量组，仔猪止痢颗粒药物对照(阳性药物对照)组和阳性对照(患病不给药)组，每组各30头。所有试验组用药途径均为拌饲，分2次/d(间隔8 10h)，连用3d。按仔猪 耳号建立病历档案，从给药当日起，每天观察并按组逐头记录仔猪的精神状态、饮食状况、腹泻程度和粪便性状，好转所需时间等，观察期为7d。观察期结束后于IOd分别称重，统计各组的日均增重(已死亡猪的日均增重记为0)，详细分组及给药试验处理见表I。表I各试验组处理情况
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il3扩大临床疗效试验选择该场25 40日龄、体重为5 7. 5kg的自然患白痢断奶仔猪80头，经确认仔猪未用过任何药物治疗后，逐头编打耳号，将同窝仔猪随机分为2组即连翁止痢颗粒治疗组和仔猪止痢颗粒治疗(阳性药物对照)组，每组40头。两种药物都按体重0. 5g/Kg/d剂量(其中连翁止痢颗粒根据上述实验性治疗试验结果确定剂量，仔猪止痢颗粒按说明书给药)分2次(间隔8 10h)拌饲给药，连用3d。按仔猪耳号建立病历档案，用药后每天观察记录疗效情况，观察期为7d。因本不同窝试验仔猪日龄和初始体重存在一定的个体差距，故不再进行日均增重统计，其治疗结果判断以仔猪排出粪便性质变化，作为药物治疗效果的判定标准，治疗效果分痊愈、有效、无效3个级别，具体标准如下痊愈治疗后患猪粪便成型，干稀适度，颜色正常，尾根腹侧及肛门周围粘有粪便，仔猪活动、精神和食欲恢复正常，观察期内无复发。有效治疗后患猪粪便明显变稠，拉稀次数明显减少。仔猪食欲、活动和精神状态有明显改善。
无效治疗后患猪精神、食欲、粪便无明显改善，甚至加重或死亡。5 结果5. I药物耐受性试验结果试验期间，连翁止痢颗粒2g/Kg/d剂量组和lg/Kg/d剂量组试验仔猪采食、饮水、排便均未见异常和任何副作用及中毒现象。给予医用淀粉的空白对照组有3头仔猪分别在试验开始后2 4d内出腹泻，在未经治疗的情况下，经4 5(1逐步恢复，该组其余试验仔猪均未见出现任何异常现象。观察期结束后分别称重，日均增重统计结果显示连翁止痢颗粒中剂量组最高，为0. 259Kg/d，其次是连翁止痢颗粒高剂量组为0. 258Kg/d，空白对照组最低为0. 252，但3组间无明显差异(P>0. 05)，详细结果见表3。最后各组随机扑杀2头仔猪，经剖检胃、肠、心、肝、脾、肾、输尿管等脏器均未见明显病理变化，说明连翁止痢颗粒2g/Kg/d以下剂量对仔猪是安全的。表2耐受性试验各组生长性能n=20，25
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IIIft P；Il 2 ±U, OHB0. 259±0. 01:10. 252士(>, OliH5. 2实验性疗效试验结果至试验结束，连翁止痢颗粒高剂量组、中剂量组和药物对照组的治愈率分别为66. 7%,70. 0%和73. 3% ;总有效率分别为83. 4%,86. 7%和86. 7%，日均增重分别为:0. 129±0. 066Kg、0. 132±0. 064Kg和0. 131 ±0. 080Kg，且均无仔猪死亡，说明3组疗效相当，经统计分析治愈率、总有效率和日均增重均无显著性差异(P>0. 05)。而连翁止痢颗粒低剂量组的治愈率为53. 3%，总有效率为66. 7%，日均增重为0. 103±0. 066Kg,与连翁止痢颗粒高剂量组、中剂量组和药物对照组的治愈率、总有效率和日均增重相比，均有显著性差异(P〈0. 05)，但又显著高于阳性对照(医用淀粉)组的治愈率(36. 7%)、总有效率(56. 7%)和日均增重(0. 084±0. 073Kg) (P〈0. 05)。连翁止痢颗粒高剂量组、中剂量组、药物对照组和阳性对照组的试验末重与日均增重均极显著地低于空白对照组(p〈0. 05)，这是因为前5组的试验动物是患白痢病的仔猪，而后者的试验动物是基本健康仔猪，所以它们在末重与日均增重之间理应有极显著差异。详细结果见表3。表3连翁止痢颗粒治疗仔猪白痢的疗效试验结果n=25，30

权利要求
1.一种治疗仔猪白痢的中药颗粒剂，其特征在于，由以下重量配比的中药原料药制备而成黄连100-300g，白头翁100-300g，老鹳草100-300g，大黄炭100_300g。
2.一种治疗仔猪白痢的中药颗粒剂，其特征在于，由以下重量配比的中药原料药制备而成黄连200g，白头翁200g，老鹳草200g，大黄炭200g。
3.权利要求I所述的颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括将白头翁、黄连、老鹳草进行提取、浓缩、然后加入大黄炭进行制粒的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取采用乙醇回流提取。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取包括以下步骤 (1)黄连、白头翁、老鹳草加入10倍量50%乙醇浸润30分钟都可使药材浸润透， (2)回流提取三次，每次I小时， (3)回收乙醇后对提取液浓缩，浓缩程度到浓缩液相对密度I.25 (60°C), (4)提取液减压浓缩至相对密度为1.25(60°C)的稠膏，加入大黄炭粉，混匀，干燥，粉碎，得到药物活性成分。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制粒包括以下步骤 药物活性成分加入辅料，混匀，加入乙醇润湿，制粒，烘干，整粒，制成。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)黄连、白头翁、老鹳草加入10倍量50%乙醇浸润30分钟， (2)回流提取三次，每次I小时， (3)回收乙醇后对提取液浓缩，浓缩程度到浓缩液相对密度I.25 (60°C), (4)浓缩液中加入大黄炭粉，混匀，干燥，粉碎，加入蔗糖和糊精，两者比例为2:1，混匀，用70%乙醇润湿,制粒,烘干,整粒,制成1000g。
8.权利要求I所述的颗粒剂的检测方法，其特征在于，包括黄连的薄层鉴别，大黄炭的薄层鉴别，白头翁药材的薄层鉴别，白头翁皂苷B4的薄层鉴别。
9.权利要求8所述的检测方法，其特征在于，其中黄连的薄层鉴别，步骤如下 (1)供试品溶液的制备 取本品粉末0. 3g，加甲醇30ml，加热回流15分钟，滤过，蒸干，残渣加甲醇IOml溶解，作为供试品溶液， (2)对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液， (3)对照药材溶液的制备 取黄连对照药材粉末0. 05g，加甲醇10ml，同法制成对照药材溶液， (4)阴性对照溶液的制备 取缺黄连阴性对照品0. 3g，同法制成阴性对照溶液， (5)薄层鉴别 以正丁醇-冰醋酸-水(7 I 2)为展开剂，硅胶G薄层板，点样量liU，展开，展距IOcm,取出，晾干,置紫外光灯(365nm)下检视， 其中，大黄的薄层鉴别，步骤如下 (I)供试品溶液的制备 取本品粉末0. 4g，加甲醇50ml，浸泡I小时，滤过，蒸干，残渣加水IOOml使溶解，再加盐酸10ml，加热回流30分钟(油浴，IlO0C )，放冷，用乙醚分3次振摇提取，每次40ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液， (2)对照药材溶液的制备 取大黄对照药材0. lg，同法制成对照药材溶液， (3)阴性对照溶液的制备 称取按处方制备工艺制备缺失大黄炭阴性对照品0. 26g，同法制成阴性对照溶液， (4)薄层鉴别· 以石油醚(30-60°0-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，羧酸甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板，点样量4 u 1，展开，展距10cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视， 其中，白头翁药材的薄层鉴别，步骤如下 取本品3g，加石油醚30ml，超声提取20分钟，滤过，残渣加70%乙醇超声提取两次，每次加70%乙醇30ml，提取时间20分钟，滤过，合并提取液，浓缩，用70%乙醇定容至10ml，作为供试品溶液， 另取白头翁药材lg，同法制备对照药材溶液， 取缺失白头翁的阴性对照样品2g，同法制备阴性对照溶液， 以氯仿-甲醇-水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，点样量2 u 1，展开，展距5cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，日光下检视， 其中，白头翁皂苷B4的薄层鉴别，步骤如下 取本品3g，加石油醚10ml，超声提取20分钟，滤过，残渣加70%乙醇超声提取两次，每次30ml，提取20分钟，滤过，合并提取液，滤液蒸干，残渣加甲醇IOml使溶解，作为供试品溶液， 再取缺失白头翁的阴性对照样品3g，同法制成阴性(同时按处方量制成的缺失白头翁样品)对照溶液； 取白头翁皂苷B4对照品，加甲醇制成每ImL含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液， 以氯仿甲醇水(60 40 10) 10°C以下放置的下层溶液为展开剂，硅胶G薄层板，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C下加热至斑点显色清晰。
10.一种权利要求I所述颗粒剂的使用方法，其特征在于，按2g/kg/d以下剂量连续拌饲给药5d，对仔猪无毒副作用；按体重0. 5g/kg/d剂量，分2次拌饲给药3d，能有效治疗仔猪白痢病。
全文摘要
本发明涉及一种治疗仔猪白痢的中药复方连翁止痢颗粒及其制备方法和应用。以黄连300g，白头翁300g，老鹳草200g，大黄炭200g为原料，按照科学的处方组成和工艺制备，由于经过体外提取，药物的有效成分可在动物的消化道内直接被吸收，大大提高了药物的生物利用度，既节约了中药资源，又可适当提高药效。方用味苦性寒之黄连为君，清热燥湿，解毒止痢；白头翁为臣，助黄连止痢；大黄炭为佐，使黄连、白头翁解毒止痢倍增；老鹳草为使，既可协君药黄连解毒，又能取其炒炭之收敛功效以助君臣止泻；四味相配，互相协同，优势互补，共收清热燥湿，解毒止痢之功。连翁止痢颗粒在使用时采用混水灌服，使用方便的特性有利于该药的推广应用。
文档编号A61K36/718GK102764314SQ201210290320
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者付海宁, 庞云露, 沈巍, 王春元, 王艳玲, 贾德强, 郝智慧, 钟英杰 申请人:青岛农业大学, 青岛康地恩动物药业有限公司, 青岛康地恩药业股份有限公司