专利名称：一种益母草注射液、其制备方法和总生物碱的检测方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域。具体而言，本发明涉及一种用于静脉滴注的益母草注射液及其制备方法和检测方法。
背景技术：
益母草为唇形科植物益母草Leonurus Japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上全草，始载《神农本草经》，列为上品，是常用中药。益母草味辛、微苦，性微寒，人心包、肝经，具有去瘀生新，活血调经的功效。传统医学将益母草及其制剂应用于治疗妇产科疾病，医家称益母草为血分圣药。
益母草的化学成分主要有(I)生物碱类益母草含总生物碱，其中益母草碱(Leonurine)、水苏碱(Stachydrine)、益母草唳和益母草宁等；(2)黄酮类5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、汉黄芩素、洋芹素-7_0_葡萄糖糠苷、大豆素、槲皮素、山柰素及其苷、芦丁等；(3) 二萜类前益母草素、益母草素、前益母草乙素；(4)脂肪酸类含延胡索酸、月桂酸、亚麻酸、油酸等；(5)挥发油类；(6)含有微量元素其中含Fe、Mn、Zn、Rb含量较高。现代研究表明益母草的药理作用有(I)对子宫、乳腺的作用益母草是我国民间常用的调经止血药，具有较强的子宫兴奋作用，其有效成分为益母草碱，对离体子宫、在体子宫和子宫血管均呈兴奋作用，使子宫收缩明显增强，紧张度增加，且持续时间增强；(2)对心血管系统的作用益母草对早期缺血，甚至接近缺血性坏死的心肌有较好的改善作用。益母草中富含多种对心血管系统有保护作用的微量元素，对心肌梗死、冠心病、心绞痛等心血管疾患有一定的防治作用；(3)对血液系统的作用益母草能显著降低红细胞压积、全血比粘度低切部分、全血还原比粘度低切部分、粘度指数和红细胞聚集指数，抑制血小板聚集作用，降低血液及血浆黏度，预防和抑制微小血管血栓形成；(4)对免疫系统的作用益母草具有活跃淋巴微循环的作用，能够扩张淋巴管，力口强淋巴管的收缩性，促进淋巴液的生成和回流，对机体恢复内环境的恒定，免疫力的提高是有益的；(5)对肾脏的作用临床研究表明益母草具有调整全身血液循环、祛除瘀滞、消除水肿、恢复肾功能的作用，可用于治疗急、慢性肾炎水肿，营养不良性水肿及病因不名之水肿。其水溶液作用微弱，在使用水溶液同时联合应用挥发油可使利尿作用增强。动物实验表明，益母草可以保护由庆大霉素所致的大鼠急性肾功能衰竭；(6)其他作用大剂量的益母草有一定抑制皮肤真菌的作用，临床上常用于荨麻疹、皮肤痒疹、疮痈肿毒及治疗女性皮肤瘙痒症，内服外用均可。实验证明益母草对许兰氏黄癣菌、羊毛状小芽孢癣菌、红色表皮癣菌、星形努卡氏菌等皮肤真菌均有不同程度的抑制作用。益母草为妇科圣药，疗效确切，临床单用较多，如益母草膏、益母草颗粒、益母草口服液、益母草胶囊、益母草片等，但均为一般水提、或水提醇沉工艺，制剂不精制，且有苦味、服用量大、疗效缓慢、不稳定的缺点；现有的益母草注射液由于容量小、含生物有效成分低，因此治疗效果不理想；此外，益母草注射液在临床应用时往往需要将益母草注射液加入葡萄糖或氯化钠注射液稀释，再经静脉滴注使用，由于滴注前的取液混合，带来了一些缺点，不仅手续繁琐，而且容易受环境、器械的污染，使用者产生输液反应如发烧、恶心、发冷、心跳过快或过缓等，严重时科危及病人的生命。。此外，目前有关益母草制剂的检测都是检测单一成分，如CN1973855A已经涉及采用指纹图谱法测定益母草注射液中的盐酸水苏碱，但益母草的主要有效成分为益母草碱和水苏碱，仅对益母草注射液中盐酸水苏碱进行测定无法全面反映注射液中生药有效成分的
精确含量。因此，目前存在对于新型益母草注射液、尤其是大容量注射液即大输液的需求。此夕卜，也需要提供一种能够对益母草注射液的生药有效成分进行精确检测的方法。

发明内容
针对上述问题，本申请的目的之一是提供一种新型的大容量的益母草注射液。本发明的另一目的是提供该大容量益母草注射液的制备方法。本发明的再一目的是提供一种能够检测益母草注射液中的总生物碱的检测方法，该方法同时检测益母草碱和盐酸水苏碱，从而可以用于反映大容量益母草注射液中药物有效成分的含量。用于实现上述目的的技术方案如下一方面，本发明提供一种益母草注射液，所述注射液包含益母草超滤液、药学上可接受的调节渗透压的化合物和任选地注射用水。其中，以250ml的益母草注射液计，该注射液包含总生物碱的含量为10_500mg ；优选地，所述注射液包含总生物碱的含量为20_250mg ；进一步优选地,所述注射液包含总生物碱的含量为40_125mg ；更优选地,所述注射液包含总生物碱的含量为45_50mg。此外，在上述益母草注射液中，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，每50ml注射液中大于10 μ m的不溶性微粒不超过20粒；大于25 μ m的微粒不超过5粒。在上述益母草注射液中，所述益母草超滤液通过包括下述步骤的方法制备取益母草，加水煎煮，合并滤液，离心处理或经过微孔滤膜处理，进行超滤；优选地，所述益母草超滤液通过包括下述步骤的方法制备a、取益母草，加水煎煮2 5次，合并煎液，1500 5000转/分钟离心处理5 30分钟或经过微孔滤膜处理，取处理后的上清液备用；b、取步骤a获得的上清液，采用分子截留量为I万 10万道尔顿的超滤膜进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用；C、取步骤b获得的超滤液，加适量盐酸调pH值至4. O 7. O，静置8 24小时以上，采用分子截留量为1000 50000道尔顿的超滤膜进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用。在步骤a中加入的水为药材的8 12倍(重量比)；使用的微孔滤膜孔径为O. 45 μ m0在步骤b和c中使用的超滤膜分别选自陶瓷膜、醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜或聚氟膜。 并且，采用的药学上可接受的调节渗透压的化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、木糖醇、山梨醇和/或右旋糖酐中的一种或几种；优选地，所述化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化钙、右旋糖酐和/或乳酸钠中的一种或几种。进一步优选地，所述的益母草注射液的渗透压为等渗，即和人的血浆渗透压相等。另一方面，本发明还提供一种益母草注射液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤 取益母草，加水煎煮，合并滤液，离心处理或经过微孔滤膜处理，进行超滤，超滤液加入药学上可接受的调节渗透压的化合物调等渗，加入注射用水或浓缩，灭菌，灌装。优选地，所述方法包括以下步骤a、取益母草,加水煎煮2 5次,合并煎液，1500 5000转/分钟离心处理5 30分钟或经过微孔滤膜处理，取处理后的上清液备用；b、取步骤a获得的上清液，采用分子截留量为I万 10万道尔顿的超滤膜进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用；C、取步骤b获得的超滤液，加适量盐酸调pH值至4. O 7. O，静置8 24小时以上，采用分子截留量为1000 5万道尔顿的超滤膜进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用；d、取步骤c获得的超滤液加入药学上可接受的调节渗透压的化合物调等渗，加入注射用水或浓缩，充氮，灭菌，灌装。其中，在步骤a中加入的水为药材的8 12倍(重量比)；使用的微孔滤膜孔径为 O. 45 μ m。所述步骤b和c中的超滤膜分别优选自陶瓷膜、醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜或聚氟膜。优选地，所述药学上可接受的调节渗透压的化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、木糖醇、山梨醇和/或右旋糖酐中的一种或几种；进一步优选地，所述化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化钙、右旋糖酐和/或乳酸钠中的一种或几种。又一方面，本发明还提供一种益母草注射液中总生物碱的检测方法，所述检测方法包括检测所述益母草注射液中益母草碱和盐酸水苏碱的含量。优选地，所述检测方法按照高效液相色谱测定，所述色谱条件包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以O. I %磷酸溶液-乙腈-甲醇(40 30 30)(体积比)为流动相，柱温为30°C，其中用三乙胺调节O. I %磷酸溶液的pH为4. O ;检测波长为276nm ;流速0. 8mL/min ;进样量20 μ I ;理论板数按盐酸水苏碱峰计算不低于3000。以下是本发明的详细描述超滤技术是分离工程新崛起的一个分支，它是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。当液体混合物在一定的压力下流经膜表面时，溶剂及小分子溶质透过膜(称超滤液)，而大分子物质则被截留，使其在原液中的浓度逐渐提高，从而实现大、小分子间的分离，达到净化提纯药液的目的。由于中药成分复杂，制剂时除了最大限度地保留有效成分外，还必须尽可能地除去杂质。在中药煎煮液中存在大量的鞣质、蛋白质、淀粉、树脂等大分子物质及许多微粒、亚微粒及絮凝物等，它们一般不具药效作用，但影响产品的质量。采用超滤技术制备中药注射剂的质量优于传统的方法。其主要特点为①由于去除了鞣质等杂质，明显提高了针剂的澄 明度和稳定性由于分离时无相变，因而有利于保持中药的生物活性和理化稳定性，易于保留原配方中的有效成分；③工艺流程及生产周期短，操作简便易行；④超滤制剂有效成分含量较常法高10% 100%，因而节约原料，同时节省大量溶剂。本发明提供的益母草大输液，在其制备过程中采用了超滤工艺，获得的大容量益母草注射液由益母草超滤液、葡萄糖或氯化钠或氯化镁或氯化钙或乳酸钠或木糖醇或山梨醇或右旋糖酐(包括大、中或小分子量的右旋糖酐)等、和/或注射用水制成。上述的大容量益母草注射液中，以250ml注射液计，总生物碱的含量为10_500mg ；优选为20-250mg ;进一步优选为40-125mg ;更优选为45_50mg。具体而言，本发明的大容量益母草注射液通过包括下述步骤的制备方法进行制备a、益母草提取液的制备取益母草，加水煎煮2 5次，合并煎液，离心处理(1500 5000转/分钟，5 30分钟)或经过微孔滤膜处理，取处理后的澄清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万 10万道尔顿的陶瓷膜或醋酸纤维素膜或聚醚砜膜或聚酰胺膜或聚氟膜等进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用；C、二级超滤取上述超滤液，加适量盐酸调pH值至4. O 7. 0，静置8 24小时以上，采用分子截留量为1000 50000道尔顿的陶瓷膜或醋酸纤维素膜或聚醚砜膜或聚酰胺膜或聚氟膜等进行超滤，压力O. 05-0. 25MPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入葡萄糖或者氯化钠等调等渗，加入注射用水或浓缩，充氮、灭菌灌装得成品大容量益母草注射液，它是由益母草超滤液、葡萄糖或氯化钠等、和/或注射用水制成；以250ml注射液计，含生药有效成分为益母草2. 5克 250克。通过以上方法制备的本发明产品是一种高品质的大输液，该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少。通过取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，发现50ml供试品中含10 μ m以上的微粒< 20粒，含25 μ m以上的微粒彡5粒，远低于国家现有的标准。此外，本发明产品还具有如下性能蛋白质取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。
鞣质取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现
浑浊或沉淀，符合规定。树脂取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。
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重金属及有害元素照铅、镉、砷、萊、铜测定法(中国药典2010年版一部附录IXB)测定，每IL含铅少于O. 6mg,镉少于O. 15mg,砷少于O. 3mg、萊少于O. Img,铜少于20mg,
均符合规定。炽灼残渣取本品2ml，依法测定(中国药典2010年版一部附录IX J)，5份平均值为1.0% (g/ml),符合规定。总固体精密量取本品10ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上蒸干，在105°C干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算。遗留残渣为I. 0% 3. 0% (g/ml),符合规定。热原取本品，依法检查(中国药典2010年版一部附录XIIIA)，剂量按家兔体重每Ikg注射I. 5ml,无热源反应,符合规定。本发明还提供了益母草注射液的检测方法，该方法主要包括对益母草注射液中的总生物碱含量进行测定。总生物碱包括益母草碱和盐酸水苏碱，主要检测条件如下照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以O. I %磷酸溶液(用三乙胺调节PH4. O) -乙腈-甲醇(40 30 30)为流动相，柱温为30°C ;检测波长为276nm ;流速O. 8mL/min ;进样量20 μ I。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备对照品贮备溶液精密称取益母草碱和盐酸水苏碱的对照品适量，加流动相溶液溶解稀释至成益母草碱和盐酸水苏碱浓度分别为30 μ g/mL和150 μ g/mL的混和对照溶液。对照品溶液精密量取对照品贮备溶液5. OmL,置IOmL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀。供试品溶液的制备精密量取本品2. 0ml，置IOml量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇勻，即得。测定法分别精密吸取上述两种溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。本发明提供了一种新型的益母草注射液及其制备方法，以及这种益母草注射液中总生物碱的检测方法。与现有技术相比，本发明提供的产品具有以下优点第一、本发明提供的益母草注射液为大容量益母草注射液，可以直接用于静脉滴注，提高益母草的临床应用水平及安全性，方便病人使用，克服了现有产品的缺点；第二、本发明的益母草注射液的制备方法结合了超滤技术，通过超滤起到除杂、除热原、除菌等作用，技术过程简单、无相变、节能、高效、无二次污染、无需高温或其他化学方法，且分离效果好，提高了益母草注射液的质量、稳定性和安全性；第三、目前有关益母草制剂的检测方法都是检测单一成分，因此不能准确、全面地反映现有益母草制剂有效成分的含量。而本发明提供的益母草注射液的检测方法采用高效液相色谱技术，其中采用的检测条件能够同时检测益母草注射液中的两个生物碱成分(益母草碱与盐酸水苏碱)，尤其是在本发明的检测条件下，这两个峰的出峰时间适中，分离良好，同时与样品中的其他杂质峰均分离良好，从而本发明的检测条件可以检测益母草制剂(如大输液)中的总生物碱(以益母草碱与盐酸水苏碱之和计)的含量，可以用于更好的控制益母草制剂的质量，具有简便、准确及可靠的特点。


以下，结合附图来详细说明
具体实施例方式图I分别为益母草碱和盐酸水苏碱对照品的HPLC谱图，其中左图为益母草碱，右 图为盐酸水苏碱。图2为本发明的大容量益母草注射液样品的HPLC谱图，其中I为益母草碱，2为盐酸水苏碱。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例I :大容量益母草沣射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加水IOkg煎煮3次，合并煎液，离心处理30分钟(1500转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. 05MPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量lmol/L盐酸调pH值至5.0，静置8小时，采用分子截留量为3000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. 2MPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入葡萄糖调等渗，再加入注射用水使总体积为100L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，总生物碱以益母草碱与盐酸水苏碱的总量计,每Iml含总生物碱为O. 05mg ;每250ml样品中总生物碱为10mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。
树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。
_4] 实施例2 :大容暈益.母草注射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草Ikg,每次加水8kg,煎煮3次,合并煎液，离心处理15分钟(3000转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的陶瓷膜进行超滤，压力O. IMPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液,加适量盐酸调pH值至5. 5,静置10小时,采用分子截留量为1000道尔顿的陶瓷膜进行超滤，压力O. IMPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入氯化钠调等渗，再加入注射用水使总体积为50L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为O. 08mg ;每250ml样品中总生物碱含量为20mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂一取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例3 :大容量益母草沣射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加水10kg，煎煮两次，合并煎液，离心处理15分钟(5000转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为6万道尔顿的醋酸纤维素膜进行超滤，压力O. 08MPa，滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量盐酸调pH值至6. 0，静置12小时，采用分子截留量为I万道尔顿的醋酸纤维素膜进行超滤，压力O. 12MPa,超滤液备用；d、取上述超滤液加入氯化钙调等渗，再加入注射用水使总体积为25L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为O. 16mg ;每250ml样品中总生物碱含量为40mg。
该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。 草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例4 :大容暈益.母草注射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加12倍量水，煎煮3次，合并煎液，离心处理20分钟(3000转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚氟膜进行超滤，压力O. 15MPa，滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量盐酸调pH值至5. 5，静置8小时，采用分子截留量为5000道尔顿的聚氟膜进行超滤，压力O. 15MPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入右旋糖酐调等渗，再加入注射用水使总体积为25L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为O. 18mg ;每250ml样品中总生物碱含量为45mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例5 :大容量益母草沣射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加10倍量水，煎煮3次，合并煎液，离心处理20分钟(4000转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚酰胺膜进行超滤，压力O. 2MPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量盐酸调pH值至6. O,静置8小时，采用分子截留量为3000道尔顿的聚酰胺膜进行超滤，压力O. 2MPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入乳酸钠调等渗，再加入注射用水使总体积为25L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为O. 2mg ;每250ml样品中总生物碱含量为50mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。
蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例6 :大容量益母草沣射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加10倍量水，煎煮3次，合并煎液，过微孔滤膜(0.45μπι)预处理，取滤液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. IMPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量lmol/L盐酸调pH值至5.0，静置8小时，采用分子截留量为3000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. IMPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入葡萄糖调等渗，浓缩至总体积为10L，灌装、灭菌得成品大容
量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为O. 5mg ;每250ml样品中总生物碱含量为125mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例7 :大容暈益.母草注射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加10倍量水，煎煮2次，合并煎液，离心处理15分钟(4000转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚酰胺膜进行超滤，压力O. IMPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量盐酸调pH值至6. 5，静置8小时，采用分子截留量为3000道尔顿的聚酰胺膜进行超滤，压力O. 2MPa，超滤液备用；
d、取上述超滤液加入乳酸钠调等渗，浓缩至总体积为5L，灌装、灭菌得成品大容量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，每Iml含总生物碱为I. Omg ;每250ml样品中总生物碱含量为250mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含1%鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例8 :大容量益母草沣射液的制备a、益母草提取液的制备与处理取益母草1kg，每次加水IOkg煎煮3次，合并煎液，离心处理30分钟(2500转/分钟)，取上清液备用；b、一级超滤取上述上清液采用分子截留量为I万道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. 2MPa,滤液备用；C、二级超滤取上述滤液，加适量lmol/L盐酸调pH值至5. 5，静置8小时，采用分子截留量为3000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤，压力O. 2MPa，超滤液备用；d、取上述超滤液加入葡萄糖调等渗，浓缩至总体积为2. 5L，灌装、灭菌得成品大容
量益母草注射液。采用实施例9中给出的HPLC法测定，总生物碱以益母草碱与盐酸水苏碱的总量计,每Iml含总生物碱为2. Omg ;每250ml样品中总生物碱为500mg。该大输液理化性质稳定，其澄明度高和微粒少，制剂性能检测不溶性微粒——取样品50ml，照“中国药典2010版附录IXR不溶性微粒检查法”第一法，光阻法检查，不溶性微粒彡10 μ m:彡20粒；> 25 μ m:彡5粒。蛋白质——取本品1ml，加新配制的30%磺基水杨酸溶液1ml，摇匀，放置5分钟，未出现浑浊，符合规定。鞣质——取本品1ml，加新配制的含I %鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀，符合规定。树脂——取本品5ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷IOml振摇提取，分取三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞试管中，加水3ml，混匀，放置30分钟，未出现沉淀，符合规定。草酸盐——取本品2ml，加3%氯化钙试液2 3滴，放置10分钟，未出现混浊或沉淀，符合规定。实施例9 :大容暈益.母草注射液总生物碱的HPLC检测
I实验仪器和试药I. I 仪器安捷伦1100高效液相色谱仪(Agilent Chemstation工作站)；色谱柱SunfireC18 (250mm X 4. 6mm, 5 μ m)；Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)；Kromasil C18 (150mmX 4. 6mm, 5 μ m)；Aichrom Bond_AQ-C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；I. 2 试药样品由西安千禾药业有限公司药研中心提供。对照品益母草碱(安徽新星药物研究所，纯度99. 0% )盐酸水苏碱(中国药品生物制品检验所，批号712-0703，供含量测定用)试剂甲醇、乙腈等为色谱纯，水为自制超纯水，其它试剂均为分析纯2色谱条件在预实验过程中分别选用Sunfire C18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m) >KromasilC18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)、Kromasil C18 (150mmX 4. 6mm, 5 μ m)和 AichromBond-AQ-C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)四种不同的色谱柱进行研究，从色谱峰的峰形及分离效果来看Sunfire C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)柱的分离度比较好。试验中，曾考察多种流动相系统(如甲醇-缓冲液；乙腈-缓冲液等)对益母草碱和盐酸水苏碱分离的影响，同时对检测波长、缓冲液的pH、流速及柱温进行考察，结果在流动相O. I %磷酸溶液(用三乙胺调节pH4. O)-乙腈-甲醇(40 30 30)(体积比)；流速0. 8mL/min ;柱温30°C时益母草碱和盐酸水苏碱出峰时间适中，分离良好，同时与样品中的其他杂质峰均分离良好。研究的色谱条件如下检测波长276nm；柱温3(TC;流动相0· I %磷酸溶液(用三乙胺调节ρΗ4· O)-乙腈-甲醇(40 30 30)(体积比);流速:0. 8mL/min ；3色谱条件的评价通过不同实验人员、色谱系统和研究对象对色谱条件及系统适应性进行考察，结果如下a.分离度样品中益母草碱、盐酸水苏碱与其它杂质峰达到良好的分离，分离度R> I. 5 (益母草碱和盐酸水苏碱对照品的色谱图见图1，本发明的益母草注射液样品的色谱图见图2)。b.理论板数对照品及样品中以盐酸水苏碱峰计，理论板数不小于3000。4 结论以0.1%磷酸溶液(用三乙胺调节pH4. O)-乙腈-甲醇(40 30 30)为流动相；流速为O. 8mL/mm ;检测波长为276nm ;柱温为30°C。理论板数按盐酸水苏碱峰计不小于3000的色谱条件能满足检测要求。5方法学研究对本发明的检测方法进行了方法学研究，具体如下5. I对照品溶液的制备精密称取益母草碱、盐酸水苏碱的对照品适量，加流动相溶液溶解分别配成O. 5mg/mL、lmg/mL的对照品溶液。5. 2供试品溶液的制备由于样品为大容量注射剂，在澄明度和微粒上都有严格控制，并且尽量保留注射液中各物质的实际存在状态，所以采用样品直接稀释后进样的方法。精密量取本发明产品2ml，置IOml量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，即得。5. 3线性关系的考察精密吸取益母草碱对照品溶液O. 5mL、l. OmL,2. OmL,4. OmL,5. OmL至IOmL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，备用。精密吸取盐酸水苏碱对照品溶液I. OmL,2. OmL,4. OmL,5. OmL,10. OmL至IOmL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，备用。吸取各浓度溶液20 μ L注入高效液相色谱仪。分别测得益母草碱、盐酸水苏碱的峰面积，建立以成分含量为横坐标，峰面积为纵坐标的标准曲线方程，结果见表I。表I益母草两种对照品的线性关系
权利要求
1.一种益母草注射液，其特征在于，所述注射液包含益母草超滤液、药学上可接受的调节渗透压的化合物和任选地注射用水。
2.根据权利要求I所述的益母草注射液，其特征在干，以250ml注射液计，所述注射液包含总生物碱的含量为10-500mg ； 优选地，所述注射液包含总生物碱的含量为20 250mg ； 进ー步优选地，所述注射液包含总生物碱的含量为40 125mg ； 更优选地，所述注射液包含总生物碱的含量为45 50mg。
3.根据权利要求I或2所述的益母草注射液，其特征在于，所述益母草注射液每50ml中大于10 μ m的不溶性微粒不超过20粒；大于25 μ m的微粒不超过5粒。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的益母草注射液，其特征在于，所述益母草超滤液 通过包括下述步骤的方法制备 取益母草，加水煎煮，合并滤液，离心处理或经过微孔滤膜处理，进行超滤； 优选地，所述益母草超滤液通过包括下述步骤的方法制备 a、取益母草，加水煎煮2 5次，合并煎液，1500 5000转/分钟离心处理5 30分钟或经过微孔滤膜处理，取处理后的上清液备用； b、取步骤a获得的上清液，采用分子截留量为I万 10万道尔顿的超滤膜进行超滤，压カO. 05-0. 25MPa，超滤液备用； C、取步骤b获得的超滤液，加适量盐酸调pH值至4. O 7. 0，静置8 24小时以上，采用分子截留量为1000 5万道尔顿的超滤膜进行超滤，压カO. 05-0. 25MPa，超滤液备用； 进ー步优选地，在步骤a中加入的水为药材的8 12倍；使用的微孔滤膜孔径为O.45μπι;所述步骤b和c中的超滤膜分别选自陶瓷膜、醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜或聚氟膜。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的益母草注射液，其特征在于，所述药学上可接受的调节渗透压的化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、木糖醇、山梨醇和/或右旋糖酐中的ー种或几种； 优选地，所述化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化钙、右旋糖酐和/或乳酸钠中的ー种或几种。
6.根据权利要求I 5中任一项所述的益母草注射液，其特征在于，所述注射液的滲透压和人的血浆渗透压相等。
7.—种益母草注射液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤 取益母草，加水煎煮，合并滤液，离心处理或经过微孔滤膜处理，进行超滤，超滤液加入药学上可接受的调节渗透压的化合物调等滲，加入注射用水或浓缩，灭菌，灌装； 优选地，所述方法包括以下步骤 a、取益母草，加水煎煮2 5次，合并煎液，1500 5000转/分钟离心处理5 30分钟或经过微孔滤膜处理，取处理后的上清液备用； b、取步骤a获得的上清液，采用分子截留量为I万 10万道尔顿的超滤膜进行超滤，压カO. 05-0. 25MPa，超滤液备用； C、取步骤b获得的超滤液，加适量盐酸调pH值至4. O 7. O，静置8 24小时以上，采用分子截留量为1000 5万道尔顿的超滤膜进行超滤，压カO. 05-0. 25MPa，超滤液备用；d、取步骤C获得的超滤液加入药学上可接受的调节渗透压的化合物调等渗，加入注射用水或浓缩，充氮，灭菌，灌装。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中加入的水为药材的8 12倍； 优选地，步骤a中使用的微孔滤膜孔径为O. 45 μ m ; 优选地，所述步骤b和c中的超滤膜分别选自陶瓷膜、醋酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜或聚氟膜。
9.根据权利要求6 8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述药学上可接受的调节渗透压的化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、木糖醇、山梨醇和/或右旋糖酐中的ー种或几种； 优选地，所述化合物选自葡萄糖、氯化钠、氯化钙、右旋糖酐和/或乳酸钠中的ー种或 几种。
10.一种益母草注射液中总生物碱的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括检测所述益母草注射液中益母草碱和盐酸水苏碱的含量； 优选地，所述检测方法按照高效液相色谱测定，所述色谱条件包括 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以O. I %磷酸溶液(用三こ胺调节PH4. O) -こ腈-甲醇(40 30 30)为流动相，柱温为30°C;检测波长为276nm ;流速0. 8mL/min ;进样量20 μ I ;理论板数按盐酸水苏碱峰计算不低于3000。
全文摘要
本发明提供了一种益母草注射液及其制备方法，所述注射液包含益母草超滤液、药学上可接受的调节渗透压的化合物和任选地注射用水。本发明提供的益母草注射液为大容量注射液，生药有效成分高，理化性质稳定，可直接用于静脉注射。本发明还提供了益母草注射液中总生物碱的检测方法，该方法可以同时检测益母草注射液中的益母草碱和盐酸水苏碱，能够更好的反映益母草注射液中总生物碱的含量。
文档编号A61P15/00GK102846704SQ20111017532
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者胡小虎, 李文强 申请人:西安千禾药业有限责任公司