专利名称：用表达自杀基因的间充质干细胞进行细胞介导癌症基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及癌症治疗领域，以及细胞分离和基因改变的领域。更具体地，其涉及使用诸如胸苷激酶之类自杀基因转染的干细胞治疗癌症。
背景技术：
癌症是当今世界面临的最大的健康挑战之一，每年有超过1000万个的新癌症病例。据来自美国癌症协会的信息，2007年报道的癌症新病例超过140万。据来自美国国家卫生研究院的信息，在美国治疗癌症患者每年的直接费用约780亿美元。在中国，癌症是导致死亡和疾病的头号原因。据来自MS Global Insights的信息，受人口老龄化、更好医疗条件以及还有很多年专利保护期的进一步的创新产品的引入等因素的驱动，到2012年，中国的癌症治疗市场价值将超过400亿美元。全球对抗癌症的斗争在继续，需要更多的方式来治疗不能用当前可用的抗癌药物治疗的病例。在观察发育成纤维细胞集落形成细胞(CFU-F)的细胞群时，最先识别出成人间充质干细胞(MSC)。从那时起，这些细胞的治疗用途和临床应用已被建议用于组织工程、基因治疗、器官移植和组织损伤。参见P M等，Open Orthop J.2011 ；5 (Suppl 2):253_60。以干细胞为基础的癌症治疗已由M.Cihova等在MolPharmaceutics 2011,8,1480-7中进行了概括评述。已发现MSCs深入(home)到肿瘤微环境中(Mishra PJet al.，Cancer Res 2008 ；68:4331-9 ；Hall B et al.，Handbook of ExperimentalPharmacology2007 ； (180):263-83)。它们被用来作为载体在体内提供临床相关的各种抗癌药物，包括细胞因子(Elzaouk L et al., Exp Dermato 2006 ; 15:865-74)、干扰素(Nakamizo A et al., Cancer Res 2005 ；65:3307-18 ；Studeny M et al., J Nat CancerInst 2004;96:1593-603.)、前药(Miletic H et al.，Mol Ther 2007 ；15:1373-81 ；Kucerova L et al.，Cancer Res 2007 ；67:6304-13.)或复制型腺病毒(Sonabend AM etal., Stem Cells 2008 ；26:831-41 ；Chan J et al., Stem Cells 2005 ；23:93-102.)。已在肿瘤转移模型中使用转基因祖细胞系对治疗效果进行了探索(Aboody KS et al.，PLoSONE 2006 ；1:e23)。Myers TJ 等在 Expert Opin Biol Ther.2010Dec ；10(12): 1663-79 中对间充质干细胞和基因治疗进行了评述。Gu C等已用老鼠实验脑膜胶质瘤模型对遗传工程化间充质干细胞的治疗效果进行了测试，参见Cancer Lett.2010May 28 ；291 (2):256_62。Bak XY等建议将杆状病毒转导的骨髓MSC用于系统性的癌症治疗，参见Cancer Gene Ther.20100ct17(10):721-9。Amano S等建议将遗传工程化的骨髓衍生的间充质干细胞用于胶质瘤基因治疗，参见Int J Oncol.2009Dec ；35(6): 1265-70。利用工程化间充质干细胞的靶向肿瘤基质已被建议用于减少胰腺癌的增 长，参见Zischek C et al., Ann Surg.2009Nov ；250(5):747-53.Erratum in:Ann Surg.2010Jan ；251 (I):187。根据 Matuskova M et al., CancerLett.2010Apr I ；290(1):58_67，表达HSV-TK的间充质干细胞已被认为能对人脑胶质瘤细胞施加旁观者效应。Uchibori R等已建议将产生逆转录病毒载体的间充质干细胞用于革巴向自杀肿瘤基因治疗，参见J Gene Med.2009 May ；11 (5):373_81。Dai LJ等在CancerLett.201 IJun I ；305(1):8-20中对在癌症治疗中间充质干细胞的潜在影响进行了论述。美国专利公布号US 2011/250188A1涉及用于肿瘤治疗的LCMV-GP-VSV的假型载体和肿瘤浸润病毒产生细胞。美国专利US 2008/0241115A1涉及使用基因改造的间充质干细胞来表达用于治疗癌症的自杀基因。美国专利US 2010/0233200A1涉及编码治疗性多肽和用以清除转导细胞的安全元件的载体。在其技术能 商业可行地用于人类治疗之前，这样的背景研究还需要进一步发展。

发明内容
本发明提供一种使用表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)的细胞介导的癌症基因治疗形式。本发明的MSC通过使用永生化的MSC系以及筛选具有免疫学特性的MSC以防止移植物抗宿主反应，可最优化为即用型(off-the-shelf)产品。根据本发明的治疗个体所罹患的肿瘤的方法，其通常包括下述步骤:a)向个体施予重组表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)群；b)等待足够时间使得至少一些所述间充质干细胞从它们在步骤a)中的施予部位迁移至所述肿瘤所处的部位或所述肿瘤所处部位的附近；以及然后c)给予所述个体有效量的前药，藉此，由位于所述肿瘤部位或者其附近的所述间充质干细胞表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。作为即用型产品的用途，这些细胞可以被表征为“多向”。此术语是指细胞足够无免疫原性，从而可以将其给予人群中各种基因型的个体而不必考虑组织配型。对于群体中的大多数，有效比例的间充质干细胞将迁移到肿瘤而不会被个体的免疫系统去除或者导致失效。多向性细胞可以包含在现成的医药产品中，而无需预先知道什么个体将接受治疗，或个体各自的组织类型。通常，MSC来自已被永生化的细胞系，永生化是通过使用诸如慢病毒之类的载体用SV40大T抗原转染进行的。优选地，MSC是胚胎间充质干细胞或来自构成多形性免疫图谱(profile)的源的细胞。典型的自杀基因是胸苷激酶(例如，来自HSV)，对于胸苷激酶，前药是更昔洛韦(gancicloir)。其他自杀基因和前药在本公开的后文列明。本发明的另一实施方式是用于药物或用于制备药物的产品。这些产品包括重组表达自杀基因的间充质干细胞系。优选地，MSC是胚胎间充质干细胞或来自构成多形性免疫图谱的另一个源的细胞。再者，MSC通常来自已被永生化的细胞系，永生化是通过使用诸如慢病毒之类的载体用SV40大T抗原转染进行的。可以使用自杀基因转染细胞，与此同时进行永生化，或作为单独的步骤进行。这种细胞系可用于制备治疗癌症的药物组合物。该组合物将包括本发明的MSC群，以及生理相容的缓冲剂或其他赋形剂。本发明还提供了一种用于治疗个体肿瘤的药剂盒(kit)。该药剂盒可包含本发明的药物组合物以及相应的前药，其中在该组合物的MSC中的自杀基因的表达导致前药被转换为对肿瘤细胞致命的药物。根据本发明方法，这样的药物组合物和药剂盒通常与使用指南一起包装。根据下述的说明，本发明的其他实施方式将是明显的。


图1显示人类胚胎BMSC的干细胞的特性。I㈧显示单集落形成能力。I⑶显示与人类成人的MSC相比，人类胚胎骨髓MSC的多向分化潜能。图2显示由流式细胞仪检测到的人类胚胎骨髓衍生MSC的表面标记。图3提供了在转导BMSC编码大和小T抗原的SV40的质粒(上)以及TK和GFP共表达质粒(下)的基因图。图4显示了 MSC集落(上)、用免疫印迹(Western blot)测得的SV40的表达(中)和在4批转导MSC中的SV40的表达(下)。图5显示了 MSC的GFP阳性集落(上)、挑选集落的基因表达(中)和SV40_TK_GFP表达的MSC形态。图6(A)显示本发明的基因转导的MSC的示例性表面标记。 图6 (B)显示了 SV40-TK-GFP-过表达hfBMSC的表面标记。
图7(A)显示转导后分选MSC的工作流程。
图7(B)显示了从分选的细胞群鉴定的单一集落(10X物镜)。图8显示转导后MSC的成骨和成脂分化能力。图9显示转导后MSC的细胞增殖。图10显示在人类前列腺癌细胞的存在或缺乏的情况下hfBMSC的跨孔迁移能力的
研究结果。图11显示慢病毒转导对BMSC朝向肿瘤迁移的影响。图12显示，在SV40-TK-GFP人类胚胎MSC共培养中的GCV对人前列腺癌细胞系(DU145)的体外细胞毒性。图13显示对转导的MSC的MLR分析结果。图14显示本发明的MSC在体内的抗肿瘤效果。
具体实施例方式本发明提供用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。对间充质干细胞(MSC)进行工程化使其表达将前药转化成杀死肿瘤细胞的药物的自杀基因。将MSC给予具有肿瘤的个体，MSC将由此迁移到肿瘤部位。然后给该个体施用前药，通过MSC表达的自杀基因该前药在肿瘤处或肿瘤附近转化成致命的形式。肿瘤对个体健康的影响因而减少或消除。本发明相对于以前的间充质干细`胞(MSC)为基础的治疗方式提供了许多改进。这些改进可单独或合并应用以生产即用型产品，使这些即用型产品具有良好特征的干细胞属性、肿瘤趋向性、低免疫原性、能够提供自杀基因至肿瘤微环境以及有适合成批生产的增殖能力。以前的MSC工作通常依靠新鲜分离的或培养的细胞，该些细胞然后被施用给个体，该个体与该细胞制剂是同源的或异源的。作为实际问题，本发明的MSC可永生化为具有公知表型的标准化的细胞源，从而可以成规模地用于商业用途。已发现，通过根据本发明将细胞永生化并可选地选择该细胞，能够建立具有持续增殖能力的混合或克隆细胞系，同时还保留深入到肿瘤细胞的能力从而可以将有效制剂递送到靶标。还发现，获得相对早期的MSC，在潜在的个体人群中可以获得相对无免疫原性的细胞群以用于药物。这些细胞因此可以给予具有广范围的不同组织类型的个体。这意味着，可以在不知道预期受体的情况下，在治疗前制备这些细胞。具有此属性的药物组合物可称作为即用型产品。干细胞的可能的源和表征用于本发明的MSC制剂的起始细胞群可能要从个体发生(ontogenetically)的原始源获取。创造这项发明所做的实验研究表明这种获取方式提供了几个优势。首先，细胞可以更好地适应组织培养，有更大的增殖能力，并可能更适合基因的改变和永生化。其次,个体发生(ontogenetically)的原始细胞一般有所需的跨广泛组织类型的相对无免疫原性的属性。除非MSC对于预期的受体是自体的，否则MSC给人类的用药几乎不可避免地会涉及细胞系和受体之间的组织类型的差异。通常情况下，组织移植会导致免疫初始(naiVe )个体的IV型移植物抗宿主反应，或导致具有预制抗体的个体的超急性排
斥反应。免疫反应可能在细胞与个体的目标肿瘤细胞进行反应之前就将所述细胞清除，或阻止随后的相同细胞剂型的有效性。然而，可用作本发明的细胞系或药物组合物的起始群的早期MSC可能在个体体内是免疫豁免的，或激起沉默(muted)应答。这在以下示例中进行证实，人类的MSC可以在动物模型的异种移植(xenograph)中使用，并仍然有效地将自杀基因递送至肿瘤部位。示例性的起始MSC可从第二或第三孕期胚胎组织中获得:特别是从骨髓中(例I)获得。原理上，胚胎MSC也可以从胚胎间充质细胞、中胚层、脐带血、胚胎组织匀浆或其他胚胎组织中获得。人的多能间充质干细胞也可以从羊水分离(Tsai MS et al., HumReprod.2004Jun ；19(6):1450-6)。MSC可根据功能特性和表型标记进行表征。例如,它们可能是⑶34-ve,⑶44+ve,CD73+ve，和CD90+ve (例3)。美国专利US 2006/0166214A1提供了检测间充质干细胞的标记系统和区分间充质干细 胞的方法。也请参见P M等在Open Orthop J.2011 ；5 (Suppl 2):253-6中对用于间充质干细胞的细胞表面标记的评述。MSC群也可由功能性特征进行表征，这些功能性特征如分化为成骨、成脂或软骨组织的能力和/或深入到肿瘤细胞的能力。只要细胞有深入肿瘤和自杀基因表达的属性,这些功能就不是绝对必要的。然而，表型标记可用于细胞制备以从其他细胞类型中筛选出所需的MSC。它们也可用于不同阶段的质量控制，例如，在初始分离时、经过一段时间组织培养后、在永生化后、在转导以表达自杀基因后以及在制备药物广品后。永生化一旦源MSC适应了组织培养，就可以对其进行处理以提高增殖能力和/或增殖率。有几种方法可用于哺乳动物细胞在培养基中的永生化。病毒基因，包括猿猴病毒40(SV40)T抗原、EB病毒(EBV)、腺病毒Ela和Elb、和人类乳头状瘤病毒(HPV) E6和E7，可诱导不同类型的细胞永生化。在大多数情况下，病毒基因通过使诱导细胞进入复制性衰老状态的抑癌基因(P53，Rb和其他)失活来实现永生化。实现细胞永生化的另一种方法是通过表达端粒酶逆转录酶蛋白(TERT)。这种蛋白在大多数体细胞中是不活跃的，但当hTERT外源性表达时，细胞能够维持足以避免衰老的端粒长度。一些对端粒酶-永生化的细胞株的分析已证实，细胞保持了稳定的基因型以及保留了关键的表型标记:见美国专利N0.7195911。
SV40T抗原已被证明是在培养基中转化许多不同类型细胞的可信赖试剂。细胞可通过象慢病毒这样的递送载体转染关键SV40基因而被永生化，而不是感染病毒SV40本身。可选地，同样的载体可用于同时递送自杀基因(下文)，或者是象绿色荧光蛋白(GFP)这样的标记基因。合适的载体是市售的。例如,Capital Biosciences提供的重组慢病毒载体，该载体含有SV40大和小T抗原，可表达用于基因特异性的细胞永生化的突变pLent1-SV40基因。MSC 一旦以这样的方式处理后，就可测试它们的增殖能力，例如，使用标准的BrdU试验(3例)。如果细胞的增殖特性不是最佳的，细胞群还可以接受几轮的永生化。也可能通过同时转染诸如SV40T抗原基因以及细胞标记物来对增殖能力提高的细胞进行富集。例如，标记物可以编码在相同的载体中，通过IRES把它与SV40抗原分隔开来。如果标记物是化学发光的或象绿色荧光蛋白(GFP)这样生物发光的，细胞可以通过荧光激活细胞分选来富集。另外，如果标记物是独特的细胞表面抗原，被转染的细胞可用特异性针对标记物的荧光抗体来富集。使用者可对细胞进行任意按需组合的多轮细胞永生化和富集。自杀基因转导本发明的MSC经过基因改造以表达自杀基因。可用任何合适的使自杀基因的表达由在祀组织或肿瘤细胞中具有活性的启动子控制的载体。可选择在所有细胞具有活性的启动子，如CMV启动子。此外，也可以选择启动子使得自杀基因是组织特异性的。这意味着它只在目标特征的细胞中表达。例如，针对前列腺癌的药剂可包括在PSA启动子控制下的自杀基因。载体可以选择性地包括诸如SV40T抗原的永生化成分，以使得永生化与自杀基因的转导可一步完成。载体可以选择性地包含荧光标记物或细胞表面标记物，以协助随后富集表达自杀基因的被转导细胞。

一旦自杀基因表达到足够水平的细胞群已经建立，其疗效可通过该细胞群和来自肿瘤细胞系(优选与拟接受治疗的人群的目标肿瘤的类型相同)的细胞群在体外结合的方法来测试。MSC有机会表达自杀基因以后，将前药添加到培养基中，然后测定由此产生的对肿瘤细胞的毒性。按照本发明的治疗方法，疗效可用合适的动物模型(例7)进行活体测试。在本发明中的术语“自杀基因”是指表达能够把特定的前药转换成对目标肿瘤细胞具有毒性的药物的酶的基因。这种药物可以对或可以不对把它传递到肿瘤部位的MSC有毒性。虽然来自于HSV的胸苷激酶(TK)已经作为本发明的自杀基因原型，还有其他选择。根据靶细胞类型、预期的效果、和前药的适用性，表I所示的基因药物组合可以根据本发明进行测试和开发。(表改编自 W.A.Denny, J.Biomedicine Biotechnol 1:48-70,2003年)。
权利要求
1.治疗个体所罹患的肿瘤的方法，其包括: a)向该个体施予重组表达自杀基因的间充质干细胞群； b)等待足够时间使得至少一些所述间充质干细胞从它们在步骤a)中的施予部位迁移至所述肿瘤所处的部位或所述肿瘤所处部位的附近；以及然后 c)给予所述个体有效量的前药，藉此，由位于所述肿瘤部位或者其附近的所述间充质干细胞表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞群是多向性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞已被永生化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过转染SV40大T抗原使所述细胞永生化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是胚胎间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述自杀基因是胸苷激酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述前药是更昔洛韦。
8.多向性间充质干细胞系，其重组表达自杀基因。
9.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述细胞已被永生化。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述细胞已通过转染慢病毒永生化。
11.根据权利要 求8所述的细胞系，其中所述细胞是胚胎间充质干细胞。
12.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述自杀基因是胸苷激酶。
13.用于治疗癌症的药物组合物，其包括根据权利要求8所述的间充质干细胞系以及生理学上相容的缓冲液。
14.用于治疗个体所罹患的肿瘤的药剂盒，其包括: a)根据权利要求8所述的药物组合物，以及 b)前药，其中所述组合物的所述间充质干细胞中表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。
15.根据权利要求14所述的药剂盒，其中所述自杀基因是胸苷激酶，所述前药是更昔洛韦。
全文摘要
本发明提供一种使用表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)的细胞介导的癌症基因治疗。向有肿瘤的个体施予该MSC，让该MSC迁移到肿瘤部位，并且接着向所述个体施用前药。该MSC在肿瘤部位对自杀基因的表达将所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。肿瘤对该个体健康的影响因而能够减轻或者消除。本发明的MSC通过使用永生化的MSC系以及筛选具有免疫学特性的MSC以防止移植物抗宿主反应，可最优化为即用型产品。
文档编号A61P35/00GK103182089SQ20111045867
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月30日
发明者李刚, 李郁伟, 刘宝盈 申请人:香港中文大学