专利名称：治疗肝病的药物“疏肝酶”及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有生物活性物质及其制法，特别是关于治疗肝病药物的复蛇蛇毒制剂“疏肝酶”及其制法。
病毒性肝炎是严重危害人民健康的传染病，其中乙型肝炎危害更为严重，我国目前表面抗原携带者逾亿，现症病人近五千万，近些年来，国内外学者在慢性病毒性肝炎的流行病学、免疫学、病因学、病理学、诊断及治疗学方面进行了大量研究，取得了较大成绩，如经研究认为微循环障碍是多种疾病的病理生理基础、急、慢性肝病均为不同程度的循环障碍，包括微循环及血流动力学改变微循环障碍又加重了肝功能损害，促进黄疸发生和加重。多年来不少学者采用了改善和活跃微循环药物治疗肝炎，如茛菪类药物、小剂量肝素、丹参、三七、654-2等都有一定的疗效，但是并不理想。
根据中医关于肝胆病的病因和病理方面的理论和关于循环障碍理论，本发明的目的为从生物体中提取能活血化瘀、改善微循环，能有效治疗肝炎病的具有生物活性的成分，进而制成可临床使用的药物制剂。
本发明的产品疏肝酶为精制复蛇蛇毒的水溶液，其中含精氨酸醋酶活力单位为0.25～1.00u/ml，含肝细胞生长因子为0.001～0.100u/ml，必要时其中含VC20～50mg/ml、低分子右旋糖肝3.0mg/ml。制备疏肝酶的原料是复蛇蛇毒，最好是江浙复蛇的蛇毒。这种蛇毒的冻干品为黄色晶形粉末，经两次层析提纯而后配制而成。其制备工艺为精氨酸酯酶活力单位在0.35u/ml以上的复蛇蛇毒溶于Tris(三羟甲基氨基甲烷)-Hcl缓冲液中两者在溶液中浓度分别为0.05；3.66mol)，然后用DEAE-Sepnadex(二乙氨基乙醇-交联葡聚糖)A50～75先后用Naoh和Hcl溶液处理，然后用无离子水洗至中性，将其悬浮在Tris-Hcl中再均匀装柱，用缓冲液平衡过液)，用缓冲液冲洗不吸附蛋白质，然后再用加入Nacl的缓冲液洗脱(Nacl浓度为0.8～1.0mol)，收集具有精氨酸酯酶活性部分，经饱和硫酸铵沉淀、离心、透析脱盐、冰冻干燥而得一次层析产物。二次层析是将一次层析所得冰冻干燥的产的溶于Tris-Hcl缓冲液中，经Sephadex G75～100层析柱层析，用缓冲液洗脱，收集精氨酸酯酶部分，再以饱和硫酸铵沉淀、离心、透析、冻干而成精制蛇毒。将此精制蛇毒溶于注射用水或再加入VC、低分子右旋糖肝而制成注射用药，经过滤、除菌、灌注、冻干、封口而成为针剂，每支1ml。整个操作分离工作要在较低温度下进行，最宜环境温度为10～14℃。
疏肝酶经大量基础研究证明(1)就组织学改变而言，疏肝酶对内毒素性坏死有一定程度的保护作用。(2)具有去纤、溶栓、降脂和改善微循环作用，有扩张肝胆血管、减轻肝内胆小管炎症增生和胆小管上皮细胞的肿胀、变性和坏死，并促进其再生，改善实验性胆汁郁滞的高黄状态。(3)有抗纤维化作用减轻和抑制肝纤维化生成。(4)疏肝酶中含有肝细胞生长因子，可提高肝细胞生长活性。在以上研究的基础上，疏肝酶已应用在临床，对千余例患有病毒性肝炎(包括急、慢性肝炎、乙型、慢性迁延性肝炎，肝硬化等)患者进行治疗，效果极为显著，特别是对慢性肝炎的治疗，有效率达85.0～91.7％，且复发率少。
本发明与现有技术相比其特点为(1)由复蛇蛇毒提取的具有生物活性的精氨酸酯酶为主配制而所的治疗肝病的生物制剂是一种全新的药物，无论是基础研究还是临床应用，其对患病肝组织的改善作用和治疗效果也是前所未有的。(2)从蛇毒中分离和提纯的工艺十分合理与有效。
实例1冻干黄色晶形粉末的江浙复蛇蛇毒，其精氨酸酯酶的活力单位为0.36u/mg，用Tris-Hcl缓冲液溶解，以DEAE-Sephadex A50～75柱进行层析，用缓冲液洗去不吸附的蛋白质，再用加Nacl的缓冲液洗脱，收集具有精氨酸酯酶活性部分，用饱和硫酸铵沉淀，经离心分离、透析脱盐、冰冻干燥得一次层析产物。将一次层析产物再次溶于Tris-Hcl缓冲液中，经Sephadex G75～100柱层析，用同一缓冲液洗脱，仍收集有精氨酸酯酶活性部分，依旧用饱和硫酸铵沉淀，经离心、透析、冻干，二次层析品的活力单位约为7.5u/mg。每20g蛇毒经分离提纯可得约0.035g的精制蛇毒，加注射用水配制成每毫米0.25活力单位的溶液，经过滤、除菌、灌注、封口制成每支1毫升制剂约得1000支。
实例2提取精制蛇毒法如实例1，在配制中加入VC，其量为20～30mg/ml；加入低分子右旋糖肝，其量为3.0mg/ml。
实例3临床治疗病毒肝炎升余例，特举若干典型例(1)上海奉贤传染病院对60例肝炎病人(其中淤胆8，急黄肝硬化合并14，慢活肝20，慢迁肝7，亚重肝1，急黄肝10)用疏肝酶治疗，同时对52例对照组用丹参-葡萄糖治疗。疏肝酶治疗总有效率为91.66％(显效65.0％，有效26.5％)；明显优于对照组(显效30.7％，有效32.7％，总有效率63.4％。
(2)抚顺市传染病院对120例病毒性肝炎用疏肝酶治疗，三疗程后总有效率为91.6％(显效16.6％，有效75％)。
(3)营口市传染病院对20例乙型慢性活动型肝炎用疏肝酶治疗总有效率达85％。
(4)大连市传染病院对32例乙慢活肝炎用疏肝酶治疗，并与32例对照组对比，其ALT、SB方面明显优于对照组(P值＜0.01)
权利要求
1.一种治疗肝病的药物，其特征在于药物疏肝酶为精制复蛇蛇毒的水溶液，其中含精氨酸酯活力单位为0.25～1.00u/ml，肝细胞生长因子为0.001～0.1u/ml。
2.如权利要求1所述的药物疏肝酶，其特征为疏肝酶中还含有VC20～50u/ml，低分子右旋糖肝3.0mg/ml。
3.如权利要求1或2所述药物的制法，其特征在于制造工艺为将冻干复蛇蛇毒溶于Tris-Hcl缓冲液，经DEAE-Sephadex A50～75层析柱层析，用缓冲液冲洗不吸附蛋白质，用加入Nacl的Tris-Hcl缓冲液洗脱，收集具有精氨酸酯酶活性部分，经饱和硫酸铵沉淀、离心、透析脱盐、冰冻干燥而得一次层析产物，再将一次层析产物溶于Tris-Hcl缓冲液中，经Sephadex G75～100层析柱层析，用缓冲液洗脱，收集精氨酸酯酶部分，再经饱和硫酸铵沉淀、离心、透析、冻干而成精制蛇毒；再溶于注射用水或再加入VC、低分子右旋糖肝制成注射用药液，经过滤、除菌、灌注、冻干、封口而成；操作温度为10～14℃。
4.如权利要求3所述药物的制法，其特征在于原料冻干复蛇蛇毒其中精氨酸酯活力单位在0.35u/mg以上。
5.如权利要求3所述药物的制法，其特征在于DEAE-Sephadex A50～75层析柱是将DEAE-Sephadex A50～75先后用稀氢氧化钠、盐酸溶液处理、用无离子水洗涤至中性，将其悬浮在Tris-Hcl中再均匀装柱，用缓冲液平衡过液。
6.如权利要求3所述药物的制法，其特征在于一次层析时洗脱液中Nacl浓度为0.8～1.0摩尔。
7.如权利要求3所述药物的制法，其特征在于原料冻干复蛇蛇毒为江浙复蛇蛇毒冻干品。
全文摘要
一种治疗肝炎病的药物疏肝酶，是由复蛇蛇毒经两次层析分离，饱和硫酸铵沉淀，离心、透析、冷冻干燥而得精制蛇毒，然后再经配制、过滤、除菌灌注、封口而成。每只1毫升，含精氨酸酯酶活力单位0.25～1.00u/ml，肝细胞增长因子0.001～0.1u/ml，以前VC和低分子右旋糖肝。经基础研究证明疏肝酶对内毒素性坏死有保护作用；有抗纤、溶栓、降脂和改善微循环作用；特别是含有肝细胞生长因子，可提高肝细胞生长活性。临床应用千余例，对病毒性肝炎的总有效率达85.0～91.7％。
文档编号A61P1/00GK1140588SQ9511189
公开日1997年1月22日 申请日期1995年7月19日 优先权日1995年7月19日
发明者郝文学 申请人:郝文学