专利名称：含有细胞生长因子的皮肤外用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及皮肤外用组合物，特别是涉及含有细胞生长因子的不同剂型的皮肤外用组合物及其生产方法。本发明的皮肤外用组合物具有向正常或受到紫外光，炎症和/或创伤损害的皮肤组织稳定地释放活性细胞生长因子肽，以治疗皮肤炎症和/或创伤并发挥防止皮肤萎缩、干皱的功能。
早在远古时期，人类就知道利用天然植物汁液、色素及各种带颜色的矿物质粉未制造化妆品。这些化妆品主要是以美容为目的的，而且有些成分可能对皮肤有毒害作用。在化学工业兴起并不断进步之后，逐步发明了以烃类、酯类、醇类化学物质为主，可以乳化的、有美容和皮肤保健作用的化妆品。本世纪中期以来，随着经济的飞速发展和人们物质生活的不断改善，也增加了对美容和皮肤保健的关注与追求。近几十年来，特别是在包括中国、日本和韩国在内的一些国家出现了许多加有中草药(包括植物、动物及矿物质来源的)的水或醇提取物的化妆品，这些中草药包括但不只限于人参、皂角、当归、白芷、花粉、银杏、芦荟、珍珠粉等(例如参见中国专利申请87150120、87105347、89100708、92109672、93104735、93102038，以及日本专利申请特开昭60-23325)。自七十年代中后期发现表皮生长因子(EGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)等细胞生长因子后，也已有人试图在常规化妆品中加入单独的一种或多种细胞生长刺激肽，期望以其作为活性成分制备所谓的功能性化妆品和外用皮肤保护剂。
多肽生长因子是细胞增殖和分化的激素样调节剂。已经从各种组织和细胞中分离并鉴定了许多生长因子，其中包括表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、神经生长因子、造血细胞生长因子、以及成纤维细胞生长因子。
成纤维细胞生长因子(FGF)最初是作为对BALB/c 3T3成纤维细胞具有生长促进活性的因子，从牛垂体组织中分离的(D.Gospodarowicz，Nature 249123，1974)。该分子对酸和温度敏感，并具有高的(碱性)等电点。后来发现从脑中分离的促细胞分裂因子与此前从脑垂体中分离的不同，因而基于它们具有相似的生物学活性和不同的等电点而分别称为酸性和碱性FGF(即aFGF和bFGF)。aFGF和bFGF是至少8种结构上相关的、具有肝素结合能力的分子家族的成员，它们可以选择性地激发包括中胚层细胞和神经外胚层细胞在内的许多类型细胞的生物学反应，这些细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、成肌细胞及成骨细胞。牛bFGF是具有154个氨基酸的多肽。人bFGF不同于牛bFGF在于其第121位氨基酸是苏氨酸(Thr)而不是丝氨酸(Ser)，第137位氨基酸是丝氨酸(Ser)而不是脯氨酸(Pro)。本说明书下文中将牛和人碱性成纤维细胞生长因子以及我们的共同待批专利申请(申请号96114279.0)中公开的称为FGF-2m的人碱性成纤维细胞生长因子结构类似物统称为FGF-2。
除了刺激细胞生长外，FGF还可刺激许多类型的细胞以非有丝分裂方式发生不同的反应，例如促进细胞向受伤部位迁移(趋化因子活性)、促进新的血管生成、调节神经退化和存活性(神经营养活性)、调节内分泌功能以及刺激或抑制特异性细胞蛋白质表达、细胞外基质产生及细胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。这些性质为使用FGF制备用来加速伤口愈合、神经组织修复、预防和治疗脑和心肌局部缺血(侧枝血管生成)的药物奠定了基础。再者，仅就对皮肤组织的作用来说，由于皮肤组织的第二层即真皮组织以及第三层即皮下组织均来源于胚胎的中胚层，所以皮肤组织恰好是FGF的主要作用靶位。已有许多研究工作证实，FGF可促进真皮及皮下组织内细胞的分化和增殖，加速细胞更新，并分泌更多的胶原纤维和弹性纤维及基质(Sprugel K.H.，et al.，Effect of growthfactor in vivo.l.cell ingrowth into porous supcutaneouschambers.Am.J.Pathol.129601-613，1987)，从而起到延缓皮肤衰老的作用。特别是，FGF可通过“量效效应”或者说“级联放大作用”来促进细胞的分化与增殖，其作用比激素对机体系统的影响更为细微(Schweigere L.et al.，Capillary endothelial cells expressbasic fibroblast growth factor，a mitogen that promotes their owngrowth，Nature 325257-259，1987)。FGF不同于其他激素样肽类生长因子在于它主要作用于皮肤的深层组织和细胞，而真皮层和皮下组织老化正是皮肤衰老、皱缩的根本原因。
表皮生长因子(EGF也称为尿抑胃素)是由53或52个氨基酸组成的生长因子多肽。已发现EGF对包括表皮和间质细胞及成纤维细胞在内的多种类型细胞具有促分裂活性，因而可用于加速伤口愈合及治疗消化道溃疡(Knauer，D.J.et al.，Relationship betweenepidermal growth factor receptor occupaney and mitogenic response，J.Biol.Chem.259(9)5623-5631，1984；Okeef，E.et al.，Invest.Dermatol.，78482-485，1982及美国专利4,820,690)。就该生长因子的局部应用来说，已公开了使用从尿中提取的EGF(β-尿抑胃素)作为活性成分与常规化妆品基质相混合，制成包括化妆水、软膏、乳液及口红在内的多种剂型的皮肤外用组合物或化妆品(见日本专利申请昭61-15810和中国专利申请CN1063410A)。
如众所周知，包括表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)在内的多肽生长因子均表现有不稳定性，即在常温下和含水介质中很容易失活，从而致使在实际应用中遇到困难。本发明人在利用以DNA重组技术生产的人成纤维细胞生长因子(hFGF-2)或其结构类似物制备外用治疗剂以及制备FGF-2为基本活性成分的局部外用制剂或化妆品组合物的研究过程中发现，在常规载体和赋形剂内加入一种或多种硫酸多糖类物质和选自聚乙二醇、聚丙烯酸及羟丙基纤维素等的物质作为稳定剂或活性保护剂，可以大大提高FGF-2的稳定性，使该活性蛋白质在含水介质或凝胶中的半寿期显著延长，并具有较好的抗低pH能力及较好的温度耐受性。
因此，本发明的一个目的是提供含有细胞生长因子多肽的皮肤外用组合物，该组合物含有作为活性成分的至少一种细胞生长因子，至少一种所说的活性多肽的稳定剂，以及皮肤外用上可接受的基质或赋形剂。
根据本发明的一个实施方案，其中所说的细胞生长因子选自成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子，血小板衍生的生长因子，及神经生长因子和脑衍生的神经生长因子。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的细胞生长因子是成纤维细胞生长因子和/或表皮生长因子或它们的结构类似物，并且所说的细胞生长因子可以是从天然来源提取的或以DNA重组技术产生的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质是含有水溶性润湿剂、亲水凝胶剂和pH调节剂的含水凝胶基质。根据本发明的这一实施方案，其中所说的水溶性润湿剂成分选自丙二醇、1，3-丁二醇、甘油、甘油二醇、透明质酸及其钠盐或其交联酯或由之分离的大分子透明质酸素，或脱乙酰壳多糖；所说的亲水性凝胶剂选自羧甲基纤维素，羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、黄原胶、硅硐树胶、瓜耳树胶和海藻酸及其钠盐。
根据本发明的一个实施方案，其中所说的活性蛋白质稳定剂可选自硫酸多糖例如角叉聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、硫酸甘露聚糖、多磷酸戊聚糖、硫酸环糊糊、硫酸氨基葡聚糖、羟甲基氨基多糖、羟甲基纤维素、蔗糖八硫酸酯、以及多聚甘氨酸、聚乙二醇和聚丙二醇。
根据本发明的这一实施方案，其中所说的加在水凝胶质基质中的细胞生长因子的含量为0.1-1000ppm(重量)，较好为1-100ppm；水溶性润湿剂的含量为0.5-30％(重量)较好为大约5-20％(重量)；亲水性凝胶剂的含量约为0.05-20％(重量)，较好为大约0.1-5％(重量)；且水凝胶质基中的活性多肽稳定剂含量约为0.1-1000ppm，较好约为1-100ppm。
根据本发明的另一个实施方案，其中所说的基质是由水、水溶性润湿剂、脂类及乳化剂制成的乳剂。其中所说的乳化剂可以是选自长链饱和或不饱和脂肪酸的一、二或三甘油酯、饱和或不饱和脂肪酸的脱水山梨醇酯的亲脂乳化剂；选自磷脂酰甘油二酰基酯，磷脂酰胆碱二酰基酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱二肉豆蔻酰酯、磷脂酰甘油二肉豆蔻酰酯的磷脂、以及选自聚氧乙烯脱水山梨醇的单硬脂酸、单油酸酯的两性离子型乳化剂。
根据本发明，所说的含细胞生长因子的含水凝胶型皮肤外用组合物中可以加入一种或多种选自a-生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽或其衍生物的自由基清除剂；一种或多种选自维生素A、抗坏血酸、维生素B、生物素、泛酸、维生素D、维生素E的维生素；一种或多种选自羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，及苯氧基丙醇的水溶性防腐剂。另外还可以含有选自N-乙酰-L-半胱氨酸及其衍生物的抗皮肤皱纹形成剂和选自水杨酸及其衍生物的角蛋白溶解剂，以及选自聚甲基丙烯酸甘油酯及其衍生物的润滑剂，以及选自月桂皂和二甲亚砜的皮肤渗透剂。
根据本发明的一个实施方案，其中可在所说的含水凝胶中加入适当量含油基质及乳化剂，按常规方法制成乳剂。
根据本发明的再一个实施方案，其中可利用上述适当的成分或成分组合，按常规方法制成高粘高凝胶剂或软膏。
根据本发明的再一个实施方案，其中可以利用上述适当的成分或成分组合，按常规方法制成将细胞生长因子包围在脂质体中的脂质体组合物。
根据本发明的再一个实施方案，其中可以利用上述的适当成分或成分组合，按常规方法制成预加入或使用前临时加入细胞生长因子多肽的，另外含有一种或多种护肤剂的护肤液。
根据本发明的这一实施方案，其中所说的护肤剂包括但不只限于甘油、透明质酸、维生素E、卵磷脂、氨基酸复合物、天然植物或动物提取物及天然蛋白质或多糖水解物。
本发明进一步提供了制备含有细胞生长因子的含水凝胶型护肤组合物的方法，该方法包括分别制备从天然来源提取的或以DNA重组技术生产的细胞生长因子的冷冻干燥制品，和由水溶性润湿剂、亲水性凝胶剂、活性蛋白质稳定剂及其他皮肤外用上可接受的辅助成分组成的含水凝胶基质，并在不含破坏细胞生长因子活性蛋白质之生物学活性的适当温度和pH条件下加入所说的细胞生长因子并充分混匀之。
根据本发明的一个优选实施方案，其中在使用前临时将所说的细胞生长因子的冷冻干燥制剂加入到所说的含水凝胶基质中。
本发明涉及包含细胞生长因子的含水凝胶型皮肤外用组合物，该组合物由选自成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生的生长因子、神经生长因子、脑衍生的神经生长因子的一种或多种活性多肽及含水凝胶基质组成，其中所说的细胞生长因子可以是在生产所说的皮肤外用组合物时，在不至于对生物学活性多肽造成破坏或使之失活的温度及pH条件下加入到所说的含水凝胶基质中并与之均匀混合；或者也可以分别制备并包装本发明护肤组合物的含水凝胶基质和细胞生长因子的冷冻干燥制剂，使用前临时按着规定的比例将细胞因子的冻干粉末加入到含水凝胶基质中并充分混匀之。
根据本发明的含水凝胶皮肤外用组合物，其中细胞生长因子较好是成纤维细胞生长因子和/或表皮生长因子，并且最好是成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。所说的FGF-2可以是由天然来源或以DNA重组技术制备得到的。
根据本发明的皮肤外用组合物，其中作为水凝胶基质成分之一的水溶性润湿剂可以是甘油或其衍生物，例如丙氧基化甘油和乙氧基化甘油，或者可以是丙二醇、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，透明质酸或其高分子量组分，例如分子量约在30kD以上的透明质素(Hyalectin，HAC)。透明质酸作为化妆品生产中常用的皮肤保水调节剂，由于是从天然来源提取的一组有不均一分子量的混合物，其中分子量小于30kD的组分对皮肤有较强的致过敏性，所以在本发明的含水凝胶组合物中优选使用由甘油和透明质素组成的润湿剂。实验表明，该润湿剂具有极好的吸湿性和释湿性，即在较高温度的环境下其可吸收环境中的水份，而在较大湿度的环境下则可以促进皮肤释放水份，从而使局部皮肤保持适当的湿度，即可以促进皮肤的舒适感，又有利于本发明组合物中的EGF和FGF的充分保留及发挥其生物学活性。可以按照美国专利5,166,331中所述的方法由透明质酸制备和纯化透明质素。
根据本发明的含有细胞生长因子的含水凝胶型护肤组合物，其中水溶性润湿剂的含量约占组合物总重量的在约0.1％-40％。较好为1％-30％，最好占5％-20％。
用于本发明组合物中的含水凝胶剂可以是选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素和羟丙基纤维素的纤维素醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、胶原蛋白水解物、硅酮树胶、明胶或黄原胶及其混合物。其他适用的含水凝胶剂是长链烷基丙烯酸酯，例如较好是十八烷基丙烯酸甲酯。然而，从有利于保护本发明组合物中将要加入的生物学活性多肽的角度来说，较好是使用以羟丙基纤维素为代表的纤维素醚与胶原蛋白水解物的混合物。本发明组合物中含水凝胶剂的含量一般约占组合物重量的0.01％-10％，较好为0.1-3％，最好为0.5％-1％。
在制备预先加有细胞生长因子的皮肤外用组合物的情况下，本发明组合物中含水凝胶剂的粘度较好约为400至4000Cps。相反，在制备使用前临时添加细胞生长因子冻干品的皮肤外用组合物的情况下，本发明组合物中含水凝胶剂粘度较好约为200-1000Cps。
如前所述，由于EGF和FGF等多肽细胞因子在常温和水溶液中均相对不稳定，比较容易受到各种环境因素的影响而变性失活，因此在制备本发明含有细胞生长因子的皮肤外用组合物时，一个首要的方面是尽可能地保持这些生物学活性肽在含水介质中的稳定性，延长其活性维持时间。为此目的，我们使用本实验室以DNA重组技术制备的具有人成纤维细胞生长因子活性的多肽和其结构类似物作为本发明皮肤外用组合物的基本活性物质，并利用加在含水凝胶基质中的各种不同的蛋白质稳定剂进行了大量实验研究。结果发现，特别是以本实验室制备的人重组FGF或其结构类似物(rhFGF-Arg78，Arg96.即FGF-2m)作为活性成分的情况下，在本发明的凝胶基质(甘油加CMC的0.9％NaCl溶液)中加入选自聚乙二醇、羟丙基纤维素、硫酸多糖及谷胱甘肽的一种或多种物质作为稳定剂，可以使该护肤组合物中rhFGF-2或rhFGF-2m在室温保存6个月的稳定性提高近10％(见实验实施例)。其中所说的适于用作稳定剂的硫酸多糖类物质包括聚乙二醇400、角叉聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、多硫酸戊聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸环糊精、羟甲基壳多糖、蔗糖八硫酸酯的盐、多聚甘氨酸和三甲基甘氨酸。
可以按照本领域技术人员熟知的常规方法制备上述含水凝胶护肤组合物。
虽然本发明的一个目的主要是涉及含有FGF和/或EGF及可能加入的其他细胞生长因子的含水凝胶组合物，但本发明并不只限于含水凝胶剂型的组合物。本领域技术人员可以理解到在低凝胶剂含量的、低粘度的含水介质中加入适当量的常规脂类润肤材料，例如甘油酯、植物或矿物油、链烯基酯、乙氧基化脂醇、并加入适当的乳化剂或具有乳化功能的磷脂或改性聚合物，例如非离子聚丙烯酰胺，可以将本发明的组合物制成乳剂或脂质体组合物。
乳剂，特别是水包油型乳剂是迄今将功能性护肤制剂用于皮肤的最为普遍使用的系统。因此，可以使用常规方法将本发明的组合物制成乳剂。为了有利于包含在乳剂水相中活性多肽的分散和吸收，较好使用矿物油，例如硅酮油作为油相，使用溶解有聚乙二醇和聚丙烯纤维素的等渗氯化钠溶液作为水相，并使用(C10-22)烷基丙烯酸酯，例如丙烯酸月桂酯或丙烯酸硬脂酸酯作为主乳化剂和表面活性剂。另外，还可以使用适当的碱中和剂或柠檬酸盐缓冲液将所得乳剂的pH值维持在大约中性或偏碱性的范围内。
可在制备乳液之前向上述基质材料内加入FGF-2和或EGF多肽，以及活性多肽保护剂或稳定剂，必要时加入pH调节剂。或者也可以在制成乳剂之后，于使用前加入活性多肽及其稳定剂或保护剂，并在与上述基质混匀后涂敷于皮肤表面。
适用的乳化剂可以是选自长链饱和或不饱和脂肪酸的一、二或三甘油酯、饱和或不饱和脂肪酸的脱水山梨醇酯的亲脂乳化剂；选自磷脂酰甘油二酰基酯、磷脂酰胆碱二酰基酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱二肉豆蔻酸酯、磷脂酰甘油二肉豆蔻酸酯的磷脂；以及选自聚氧乙烯脱水山梨醇的单硬脂酸酯、单油酸酯的两性离子型乳化剂。
根据本发明的另一个实施方案，还可以按本领域已知的薄层水合、反相蒸发(例如参见Szoka，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，754194-4197，1978)、及溶剂注射方法，将本发明的组合物制成FGF-2/或EGF/脂质体的高粘度凝胶或膏状皮肤外用组合物。在本发明的FGF-2/脂质体中，中性磷脂和带负电荷磷脂的含量分别约占总重量的20-50％。所使用的中性磷脂可以选自用已知方法从天然来源分离的或化学合成的磷脂，例如可以是由卵黄中提取的磷脂酰甘油酯或磷脂酰肌醇酯。另外，在脂质成分中可加入胆固醇，借以提高脂质体双层的稳定性，从而在实质上延长体外(或体内)释放的FGF和/或EGF的半寿期。再者，在该脂质体组合物中还可以含有其他用于提高脂质体稳定性并对活性多肽的稳定性和释放特征有利的成分，例如α-生育酚或聚乙氧基化的α-生育酚。
为了制备本发明的FGF-2/脂质体凝胶组合物，可以将囊泡生成脂溶解于适当的有机溶剂中，并在真空下干燥以形成薄的脂质膜。然后在强烈搅拌下使该膜水合约30分钟，以得到囊泡。将此囊泡分散于前述凝胶基质中，以使FGF-2脂质体约占组合物总重量的5-20％。上述囊泡形成脂的水合作用较好在含两性离子化合物的低导电性含水介质中进行。如此得到的脂质体含水凝胶组合物是凝胶状的，并且具有相对低的脂质浓度。
另外，也可以首先将并不处于等电点的两性电解质化合物加入到脂质膜中以形成脂质体，然后将含水介质的pH调到该介质的等电点以达到所需的凝胶状态。制备中可将FGF-2以适当的浓度溶解于用来形成脂质体组合物的含水介质中。以这种方式制成的悬液包括微囊化包裹的、脂质体吸附的、以及游离的FGF-2或FGF-2m。如上所述，可在脂质体制成后将FGF-2加入已形成的脂质体内，以产生只吸附了FGF-2的FGF-2/脂质体组合物。
可以将按上述方法制得的流体的含FGF-2脂质体组合物与空的中性脂质体混合以制成有较高脂质体浓度的膏状组合物，或者将所说的含FGF-2脂质体组合物与前述有较高粘度的含水凝胶组合物混合，以得到有较低脂质浓度的膏状组合物。如此制成的FGF-2/脂质体组合物具有大约1000-10000Cps的高粘度。
本发明提供了含有细胞生长因子，特别是成纤维细胞生长因子-2和/或表皮生长因子的皮肤外用组合物，特征在于该组合物内含有化妆品上和医药上有效量的FGF-2和/或EGF的蛋白质保护剂或稳定剂，并且该组合物可以是含水凝胶或乳剂或脂质体组合物形式的。根据本发明的组合物，一方面其中活性成分可以维持并保留较大的生物学活性，并渗入皮肤发挥其固有的生物学作用；另一方面该组合物还具有良好的皮肤感觉和残留特性，以及良好的润湿性、渗透性和吸收性。
在使用FGF-2，特别是使用本实验室生产的FGF-2结构类似物(FGF-2m)(参见共同待批专利申请№.96114279.0)作本发明皮肤外用组合物的活性成分的情况下，由于我们利用定点诱变技术将FGF-2氨基酸序列三维空间结构中暴露于分子表面的第78和96位半胱氨酸改变成了带有氨基基团的精氨酸而不是丝氨酸，因而更有利于所说的氨基基团与可加入组合物中作为保护剂的聚乙二醇分子中的羟基基团形成共价结合，借以防止FGF-2分子聚合，从而大大提高了活性蛋白质的稳定性。另外，由于本发明皮肤外用组合物主要是不含脂质或只含有很少量脂质的含水凝胶形式的，所以无论其中含有或不含有透皮吸收剂，均可使所说的活性蛋白质在局部得以最大吸收，而且具有在用药部位延迟释放的特性。
最后还应特别强调指出的是，虽然为了最大限度地保留细胞生长因子的生物学活性，可以将本发明的护肤基质与细胞生长因子多肽分开包装并在使用前临时由使用者混合并在规定时间期限内使用之，但也完全可以在生产过程中在本发明组合物的基质内直接混入这些多肽物质，而不致于在6个月内使其生物学活性明显降低。
以下借助实施进一步举例描述本发明，但这些实施例并不是以任何方式限制本发明的范围。
实验实施例本实施例中，使用培养的小鼠成纤维细胞作为靶细胞，以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测在本发明的皮肤外用组合物内加入硫酸肝素或硫酸葡聚糖和聚乙二醇对基质中所含hbFGF-2m之生物学活性的影响。
1.样品的制备和储存按照实施例1中所述的配方和配制方法制备用于本实验的含水凝胶基质。将这些基质以每管4ml的量分别加于4组12个无菌试管(20ml容积)内。第1组凝胶加入10mM(1ml)PBS作为阴性对照；第2组加入0.1ug/ml的硫酸葡聚糖溶液；第3组加1ug/ml硫酸肝素和0.2ug/ml的聚乙二醇(各0.5ml)；第4组加入溶于10mM PBS(1ml)的1ug/ml羟丙基纤维素得到有较高粘度的凝胶基质。然后分别以1ug/ml的较大剂量在上述2、3、4组样品内加入hFGF-2m。使用加有同样量hFGF-2m但未加稳定剂的凝胶基质(同第1组的较低粘度凝胶基质)作为阳性对照，并定为第5组。配制完成后将上述所有样品装在带盖的无菌玻璃瓶内置于常温(20-25℃)下放置6个月备用。
2.靶细胞的制备及检测简单地说，首先将大约106个BALB/c3T3细胞(由中国医学科学院药物研究所提供)接种于3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基中。于37℃在5％CO2孵箱内培养24小时后，用新鲜DMEM培养基稀释培养物，使血清的终浓度变为1％。继续培养2天后，向培养物内加入如上制备并储存6个月的试验样品和对照样品(2ml/105个细胞)。并加入3H-TdR(终浓度为2uCi/ml)。37℃继续保温24小时后，用冷生理盐水洗细胞3次。离心后向细胞沉淀物内加入10％三氯乙酸以沉淀蛋白质。再次用生理盐水洗2次，并加入乙醇-乙醚洗一次。用甲酸消化沉淀物后取0.1ml加于4ml闪烁瓶内测定放射计数。
按下列公式计算FGF-2m对3T3细胞DNA合成的刺激指数并得到如表1所示的结果。表中所示数据代表三次测定的平均值±标准差。
表1FGF在含水凝胶组合物中的稳定性组别处理细胞3H-TdR掺入量(CPM) 刺激指数 p值1 阴性对照(无FGF)16,065 1.00-2 凝胶+肝素+FGF 24,576 1.52 ＜0.053 凝胶+肝素+ 25,387 1.58 ＜0.05聚乙二醇+FGF4 高粘度凝胶+FGF 23,875 1.48 ＜0.055 凝胶+FGF 23,064 1.43 ＜0.05(阳性对照)从上表所示的结果可以看出，本发明护肤组合物中具有成纤维细胞生长刺激活性的多肽(FGF-2m)，在含水凝胶基质中于常温下储存6个月后仍然保留有较高的生物学活性。另外，在本发明的组合物中加入聚乙二醇400、聚丙烯纤维素及硫酸多糖等具有FGF-2稳定化功能的物质，可以有效地保护该多肽的生物学活性。在本实验系统中，与未加稳定剂或保护剂的样品相比，加入这些稳定剂可使蛋白质活性高出大约11％。
实施例1含有FGF-2m的含水凝胶及其制备使用常规混合技术混合下列(A)含水凝胶基质，和(B)含FGF-2及其稳定剂的水溶液成 分重量百分比A. 甘油20.0聚乙二醇400 2.0羟丙基纤维素2.0对羟基苯甲酸甲酯0.2聚甲基丙烯甘油酯0.6B. 重组FGF-2 10ppm葡聚糖硫酸酯0.05透明质素0.05蒸馏水加至100.0将上述原料A于55℃溶解并充分混合后，冷却到40℃，加入原料B的水溶液并用搅伴器进一步混合均匀，然后加入适当量的0.1M NaOH溶液将所得凝胶的pH调到在约6.5。如此制得的含水凝胶具有较小粘度，可以借助稳定剂有效地维持FGF-2m的生物学活性。另外，该凝胶施用于皮肤表面时具有良好的皮肤感觉，并有极好的润湿性和渗透性。
实施例2水溶液基质的制备和使用使用常规混合技术混合下列组分，以制备用作润肤液的水溶液基质成 分重量百分比甘油 20.0硫酸葡聚糖 0.02生理盐水 加至100.0将如此混合制得的水溶液单独保存，使用时由使用者抽取小量(2ml)该水溶液用以溶解置于另一无菌容器内的FGF-2的冷干粉未，待充分溶解后重新注入所说的水溶液内充分混匀并按照规定的剂量尽快使用。实施例3含有FGF-2的水包油型乳剂及基质制备使用常规混合乳化技术制备含下列成分的乳剂组合物成分重量百分比A. 聚氧乙烯 (20)脱水山梨醇单硬脂酸酯 2.0氢化羊毛脂 5.0角鲨烯 10.0蜂蜡 4.0甘油10.0硅酮油 0.5维生素E 0.1丙二醇 2.0聚乙二醇 0.5B. FGF-2 5ppm硫酸肝素 0.1透明质酸钠 0.05蒸馏水 加至100.0将油相基质原料A加热至75℃融化，混匀并冷却到40℃后加入水相B溶液，然后充分搅拌并冷却至室温。如此制得的乳液具有良好的稳定性，并且在与皮肤接触后迅速破乳并可促使含在水相中的FGF-2尽快渗入皮肤。另外该乳剂还具有良好的保水性能和除污作用。
实施例4含有FGF-2的水包油型乳剂及其制备使用常规混合乳化技术制备含下列成分的乳剂组合物成分 重量百分比A. 卵磷脂 4.0硬脂酸单甘油酯 3.0羊毛脂醇 3.0乙二胺四乙酸二钠 0.05甘油 3.0羧甲基纤维素 0.2肉豆蔻酸异丙酯 5.0对羟基苯甲酸甲酯 0.1
柠檬酸盐缓冲液适量B. FGF-25ppm硫酸氨基葡聚糖0.1维生素C 0.01蒸馏水 加至100.0将原料A置于80℃下融化，搅伴混合并冷却至50℃。然后进一步用超声波乳化器乳化，同时加入原料B的水溶液，得到均匀的霜膏样制剂。该制剂有较高粘度，在肝素等保护剂存在下更有利于维持FGF-2的生物学活性。
实施例5含有FGF-2的脂质体组合物的制备用含有卵黄磷酯酰胆碱/卵黄磷酯酰甘油/胆固醇/α-生育酚(1∶1∶0.5∶0.02重量比)的脱水脂质混合物，以常规薄层水合法制备脂质体。首先，将脂类原料溶解于氯仿/甲醇(2∶1重量比)中，并将所得溶液倒入园底烧瓶内。真空干燥后形成薄层脂质膜。向该膜上倒入10倍体积/重量的2.5％(重量/体积)甘氨酸(一种两性离子化合物)的水合缓冲液。涡流搅拌下水合1.5小时后得到凝胶样的脂质体材料。可以使用除菌装置、过滤除菌的脂质和含水溶液，在无菌室内制备该脂质体囊泡材料，以尽可能地减少微生物污染。使用Brookfield DV-II粘度计，在加入0.1％NaCL(重量)后测得该脂质体组合物的平均粘度为1.5×103Cps。
其中用于形成脂质体组合物的含水介质(上述缓冲液)内所含FGF-2的浓度可根据使用目的及凝胶涂敷部位而定，一般约占总组合物的0.1-100ppm。可在加入FGF-2的同时一并加入选自聚乙二醇、羟丙基纤维素和硫酸多糖的保护剂或稳定剂。所形成的脂质体悬液中可包含被包裹的、被吸附的以及游离的FGF-2。也可以在脂质体形成后以适当的浓度加入FGF-2。
如此得到的脂质体制剂可以单独使用，也可以在与实施例1制得的凝胶基质按适当比例混合后使用。该制剂可进一步有效地保持FGF-2的生物学活性，并可以达到在局部延缓释放活性多肽的目的。
权利要求
1.含有细胞生长因子的皮肤外用组合物，该组合物含有至少一种细胞生长因子多肽，至少一种所说多肽的稳定剂，以及皮肤外用上可接受的基质。
2.根据权利要求1的组合物，其中所说的细胞生长因子多肽选自成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生的生长因子、以及神经生长因子和脑衍生的神经生长因子多肽。
3.根据权利要求2的组合物，其中所说的细胞生长因子多肽是成纤维细胞生长因子-2和表皮细胞生长因子。
4.根据权利要求1至3中任何一项的组合物，其中所说的细胞生长因子多肽是从天然来源提取的或以DNA重组技术产生的。
5.根据权利要求1至3中任何一项的组合物，其中所说的细胞生长因子多肽的稳定剂选自聚乙二醇、聚丙烯醇、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、肝素、硫酸肝素、硫酸氨基葡聚糖、硫酸皮肤素、羟甲基氨基多糖、多硫酸戊糖、硫酸甘露聚糖、硫酸葡聚糖、角叉聚糖、硫酸环糊精、羟甲基壳多糖、透明质素、透明质酸、蔗糖八硫酸酯、多聚甘氨酸、三甲基甘氨酸和谷胱甘肽及半酰氨酸。
6.根据权利要求1的组合物，其中所说的基质是含水凝胶基质。
7.根据权利要求6的组合物，其中所说的含水凝胶基质含有水溶液性润湿剂、亲水凝胶剂和pH调节剂。
8.根据权利要求7的组合物，其中所说的水溶性润湿剂选自甘油、甘油二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、透明质酸及其钠盐或其交联酯或由之分离的大分子透明质素，或脱乙酰壳多糖；并且其中所说的亲水凝胶剂选自羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷硐、明胶、黄原胶、硅酮树胶、瓜耳树胶和海藻酸及其钠盐。
9.根据权利要求1的组合物，其中所说的基质是含有一种或多种润肤剂及多肽稳定剂的水溶液。
10.根据权利要求1的组合物，其中所说的基质是水包油型或油包水型乳剂。
11.根据权利要求1的组合物，其中所说的基质是脂质体或其组合物。
12.根据权利要求1或6至11中任何一项的组合物，其中所说的细胞生长因子多肽是在制备所说的基质的同时加入的，或者是以其冻干形成单独放置并在使用之前临时加入的。
13.根据权利要求6至11中任何一项的组合物，其中所说的细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-2和/或表皮生长因子。
14.根据权利要求13的组合物，其中所说的成纤维细胞生长因子和/或表皮生长因子在所说组合物中的含量约为1-100ppm。
15.根据权利要求1至11中任何一项的组合物，所说的基质中还含有一种或多种皮肤通透剂。
16.根据权利要求1至11中任何一项的组合物，所说的基质中还含有一种或多种维生素。
17.根据权利要求1至11中任何一项的组合物，所说的基质中还有一种或多种抗氧化剂。
18.根据权利要求1至11中任何一项组合物，其中所说的基质中还含有一种或多种自由基清除剂。
全文摘要
本发明提供了含有细胞生长因子，特别是成纤维细胞生长因子-2和/或表皮生长因子的皮肤外用组合物，特征在于该组合物内含有化妆品上或医药上有效的成纤维细胞生长因子-2和/或表皮生长因子的蛋白质保护剂或稳定剂，并且该组合物可以是含水凝胶或水溶液或乳剂或脂质体形式的。根据本发明的皮肤外用组合物，一方面其中的活性成分可以维持并保留最大的生物学活性，并渗入皮肤发挥其固有的生物学效应，另一方面该组合物还具有良好的皮肤感觉和残留特性，以及良好的润湿性、渗透性和吸收性。
文档编号A61K38/18GK1160582SQ9611428
公开日1997年10月1日 申请日期1996年12月27日 优先权日1996年12月27日
发明者林剑, 李校坤 申请人:暨南大学生物工程研究所