专利名称：一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。
背景技术：
鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭病毒性肝炎病毒引起的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性烈性传染病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使鸭病毒性肝炎发生。鸭病毒性肝炎一旦发生，在鸭群中传播很快，发病率可达100%。鸭病毒性肝炎潜伏期I 4天，突然发病，病程短促。病初精神萎靡，不食，行动呆滞，缩颈，翅下垂，眼半闭呈昏迷状态，有的出现腹泻。不久，病鸭出现神经症状，不安，运动失调，身体倒向一侧，两脚发生痉挛，数小时后死亡。死前头向后弯，呈角弓反张姿势。剖析 可见特征性病变在肝脏。肝肿大，呈黄红色或花斑状，表面有出血点和出血斑，胆囊肿大，充满胆汁。脾脏有时肿大，外观也类似肝脏的花斑。多数肾脏充血、肿胀。心肌如煮熟状。有些病例有心包炎、气囊中有微黄色渗出液和纤维素絮片。在我国同时流行由I型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎。现有的鸭病毒性肝炎疫苗为I型鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗，主要通过如下方法制备将鸭肝炎病毒弱毒株接种鸡胚，收集胚液，加入保护剂后冻干。使用时，用生理盐水稀释，采用肌肉注射成鸭或雏鸭。弱毒活疫苗存在如下问题(I)保存和运输需-20°C低温条件，不方便；(2)免疫鸭后，疫苗病毒在体内存活时间长、易排毒，且病毒对环境抵抗力强、易毒力返强；(3)疫苗的免疫效果不稳定，易受母源抗体干扰，造成免疫失败。

发明内容
本发明的目的是提供一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。本发明提供了一种用于制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的灭活病毒液混合液，由灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液和灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液组成。制备所述灭活病毒液混合液时，所述鸭肝炎病毒YB3株和所述鸭肝炎病毒GD株的
病毒剂量相等。每O. 2mL鸭肝炎病毒YB3株病毒液的病毒含量> 106· 5DELD5(i。每O. 2mL鸭肝炎病毒⑶株病毒液的病毒含量> IO6' 5DELD50O所述灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液和所述灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液具体可等体积混合。所述灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液的制备方法如下在鸭肝炎病毒YB3株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液。所述孵育的具体条件可为37°C、24小时。所述灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液的制备方法具体如下在IOOml鸭肝炎病毒YB3株病毒液中加入O. 2ml甲醛水溶液(甲醛水溶液中甲醛的体积百分含量为37-40%)，37°C孵育24小时，得到灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液。
所述灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液的制备方法如下在鸭肝炎病毒GD株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液。所述孵育的具体条件可为37°C、24小时。所述灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液的制备方法具体如下在IOOml鸭肝炎病毒GD株病毒液中加入O. 2ml甲醛水溶液(甲醛水溶液中甲醛的体积百分含量为37-40%)，37°C孵育24小时，得到灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液。本发明还保护一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，由抗原和矿物油佐剂组成；所述抗原由以上任一所述的灭活病毒液混合液和吐温-80组成；所述矿物油佐剂由白油、硬脂酸铝和司本-80组成。制备所述鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗时，所述抗原与所述矿物油佐剂的体积比具体可为I: I. 5。 所述抗原中，所述灭活病毒液混合液和吐温-80的体积比具体可为96:4。所述矿物油佐剂的制备方法具体包括如下步骤在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸招，加热使之完全溶解，然后加入6ml司本-80。本发明还保护鸭肝炎病毒YB3株和鸭肝炎病毒GD株在制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗中的应用。本发明还保护以上任一所述的灭活病毒液混合液在制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗中的应用。本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗具有如下优点(1)同时对I型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒具有预防作用；(2)使用灭活病毒制成，安全性好；(3)保存、运输(2-8°C条件)和使用方便(不需稀释)；(3)免疫效果稳定。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，所用鸭品种均为金定麻鸭购自广东省阳西县绿环生态养殖场。鸭肝炎病毒YB3株(属于I型鸭肝炎病毒)公众可从中国兽医药品监察所或广东永顺生物制药股份有限公司获得；参考文献袁率珍，范书才，李虹，等.鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]·中国预防兽医学报，2010，32(11):849-853.。鸭肝炎病毒GD株(属于新型鸭肝炎病毒):公众可从中国兽医药品监察所或广东永顺生物制药股份有限公司获得；参考文献范书才，李虹，袁率珍，等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2009，31 (10) :770-775.。鸭肝炎病毒PLK株(属于I型鸭肝炎病毒)公众可从中国兽医药品监察所或广东永顺生物制药股份有限公司获得；参考文献范书才，李虹，袁率珍，等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J]·中国预防兽医学报，2009，31 (10) :770-775.。实施例I、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备一、抗原的制备I、制备病毒液
将鸭肝炎病毒YB3株经尿囊腔接种13日龄易感鸭胚，每胚O. 2mL, 37°C孵育96小时，然后无菌收集胚液和胎儿，高速匀浆(14000r/min)，然后用60目灭菌铜网过滤，收集滤液，-40°C冻融一次，得到YB3株病毒液，每O. 2mL YB3株病毒液的病毒含量=106_ 5DELD5tl (鸭胚半数致死剂量)。实际应用中每O. 2mL病毒液的病毒含量> IO6 5DELD5tl均可。将鸭肝炎病毒⑶株经尿囊腔接种13日龄易感鸭胚，每胚O. 2mL，37°C孵育96小时，然后无菌收集胚液和胎儿，高速匀浆(14000r/min)，然后用60目灭菌铜网过滤，收集滤液，-40°C冻融一次，得到⑶株病毒 液。每O. 2mL⑶株病毒液的病毒含量=106_ 5DELD5tl (鸭胚半数致死剂量)。实际应用中每O. 2mL病毒液的病毒含量> IO6 5DELD5tl均可。2、灭活在IOOml步骤I得到的YB3株病毒液中加入O. 2ml甲醛溶液(商售的甲醛溶液中甲醛的体积百分含量为37-40%)，37°C孵育24小时，得到灭活后的YB3株病毒液。在IOOml步骤I得到的⑶株病毒液中加入O. 2ml甲醛溶液(商售的甲醛溶液中甲醛的体积百分含量为37-40%)，37°C孵育24小时，得到灭活后的⑶株病毒液。3、抗原的制备将步骤2得到的灭活后的YB3株病毒液和灭活后的GD株病毒液等体积混合，得到混合病毒液。在96mL混合病毒液中加入4ml灭菌后的吐温-80，充分溶解，得到抗原。二、矿物油佐剂的制备在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸铝，加热使之完全溶解，然后加入6ml司本-80，121°C高压灭菌30分钟，得到矿物油佐剂。三、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的制备将I体积份步骤一得到的抗原和I. 5体积份步骤二得到的矿物油佐剂采用乳化剪切机乳化，得到鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(油包水型油乳剂灭活疫苗)。每次制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗即为一个批次。实施例2、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的安全性取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对10日龄、3月龄、6月龄和12月龄的麻鸭进行单次使用剂量注射(每只注射I. 0ml)。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对10日龄、3月龄、6月龄和12月龄的麻鸭进行单次超剂量注射(每只注射2. 0ml)。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，分别对10日龄、3月龄、6月龄和12月龄的麻鸭进行单剂量重复注射(第一次注射21天后进行第二次注射，每次每只注射I. Oml )。结果均安全，无明显的局部和全身反应。实施例3、鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的效力一、抗体效价取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只3月龄金定麻鸭进行单次免疫(每只注射I. Oml), 21天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只6月龄金定麻鸭进行单次免疫(每只注射I. Oml), 21天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只12月龄金定麻鸭进行单次免疫(每只注射I. Oml), 21天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡1:24。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只3月龄金定麻鸭进行免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫,每次每只注射I. Oml),第二次免疫14天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡I 152，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗体效价均^ 1:152。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只6月龄金定麻鸭 进行免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫,每次每只注射I. Oml),第二次免疫14天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡I 152，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗体效价均^ 1:152。取3个批次的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，每一批次疫苗对5只12月龄金定麻鸭进行免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫,每次每只注射I. Oml),第二次免疫14天后检测血清中和抗体效价，对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均彡I 152，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗体效价均^ 1:152。二、攻毒试验(后代雏鸭被动保护)将4月龄金定麻鸭(产蛋种)分为2组，每组40只，分别进行如下处理第一组皮下注射实施例I制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只注射I. Oml ；第二组(对照组):皮下注射生理盐水，第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只注射1.0ml。第二次免疫后第21至28天收集各组鸭所产鸭蛋(每组随机选取100个)，进行孵育。分别于雏鸭出壳4天后、9天后、16天后和21天后各随机取20只雏鸭，其中10只肌肉注射鸭肝炎病毒PLK株、另10只注射鸭肝炎病毒GD株，每只攻毒剂量均为IOOLD5tlt5每天观察，攻毒后第14天统计攻毒保护率(即未死亡的只数占总只数的百分率)。结果表明，雏鸭的被动保护期为21天，用实施例I制备的疫苗免疫种鸭后，雏鸭出壳第4至21天的攻毒保护率均为80%以上。用生理盐水免疫种鸭后，雏鸭在各个时期的攻毒保护率均为0%。三、种鸭免疫持续期试验将4月龄金定麻鸭(产蛋种)分为2组，每组120只，分别进行如下处理第一组皮下注射实施例I制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只注射I. Oml ；第二组(对照组):皮下注射生理盐水，第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只注射1.0ml。分别于第二次免疫后I个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月，随机取第一组的10只只鸭、第二组的5只鸭，采血、分离血清并分别测定血清中的I型和新型鸭肝炎病毒中和抗体效价。用实施例I制备的疫苗第二次免疫种鸭后1-5个月，第一组所有待检鸭血清对 鸭肝炎病毒YB3株的中和抗体效价均> 1:152，对鸭肝炎病毒GD株的中和抗体效价均^ 1:152,疫苗对种鸭的免疫持续期为5个月。第二组所有待检鸭血清对鸭肝炎病毒YB3株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均< 1:4，对鸭肝炎病毒⑶株(病毒滴度为200 DELD50/0. 2ml)的中和抗体效价均< 1:4。
权利要求
1.用于制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的灭活病毒液混合液，由灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液和灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液组成。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于制备所述灭活病毒液混合液时，所述鸭肝炎病毒YB3株和所述鸭肝炎病毒GD株的病毒剂量相等。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液的制备方法如下在鸭肝炎病毒YB3株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液； 所述灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液的制备方法如下在鸭肝炎病毒GD株病毒液中加入甲醛溶液，孵育后得到灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液的制备方法中，所述孵育的条件为37°C、24小时；所述灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液的制备方法中，所述孵育的条件为37°C、24小时。
5.—种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，由抗原和矿物油佐剂组成；所述抗原由权利要求I至4中任一所述的灭活病毒液混合液和吐温-80组成；所述矿物油佐剂由白油、硬脂酸铝和司本-80组成。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于制备所述鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗时，所述抗原与所述矿物油佐剂的体积比为1:1.5。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抗原中，所述灭活病毒液混合液和吐温-80的体积比为96:4。
8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述矿物油佐剂的制备方法包括如下步骤在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸铝，加热使之完全溶解，然后加入6ml司本-80。
9.鸭肝炎病毒YB3株和鸭肝炎病毒GD株在制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗中的应用。
10.权利要求I至4中任一所述的灭活病毒液混合液在制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗。本发明提供了用于制备鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗的灭活病毒液混合液，由灭活的鸭肝炎病毒YB3株病毒液和灭活的鸭肝炎病毒GD株病毒液组成。本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗，由抗原和矿物油佐剂组成；所述抗原由所述灭活病毒液混合液和吐温-80组成；所述矿物油佐剂由白油、硬脂酸铝和司本-80组成。本发明提供的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗具有如下优点(1)同时对1型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒具有预防作用；(2)使用灭活病毒制成，安全性好；(3)保存、运输(2-8℃条件)和使用方便(不需稀释)；(4)免疫效果稳定。
文档编号A61K39/295GK102895660SQ20121041401
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者范书才, 李虹, 严悌昆, 袁率珍, 谢秉超, 张兵, 张毓金, 冯忠泽, 林旭埜 申请人:中国兽医药品监察所, 广东永顺生物制药股份有限公司