专利名称：全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域；更具体地，本发明涉及肿瘤坏死因子抗体、其编码序列、制备方法及其应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。TNF-α是一种可溶性的同源三聚体亚基，分子量为17KD(Smith，et al.，J.Biol.Chem.2626951-6954，1987)。也发现有跨膜结合的前体TNF-α，分子量为26KD(Kriegler，et al.，Cell5345-53，1988)。单核巨噬细胞在受到内毒素和其他一些刺激物刺激后，能够分泌TNF-α和TNF-β，另外其他一些细胞也能分泌TNF-α。
TNF-α在类风湿关节炎、细菌或病毒感染、慢性炎症、自身免疫疾病如爱滋病(AIDS)、恶性肿瘤和/或神经退行性疾病等的病理进程中起十分关键的作用。TNF-α单克隆抗体可以中和TNF-α，在体内对TNF-α的活性起到了负调节的作用。而且有大量研究表明，TNF-α还是引起脓毒性休克综合症的主要介质。脓毒性休克综合症患者血清中TNF-α水平升高预示着死亡率或致残率升高。临床上应用TNF-α抗体或者其受体对脓毒性休克综合症有一定疗效。
此外，TNF-α是促进HIV无症状感染状态进入AIDS的主要介质之一，而针对TNF-α的单克隆抗体能够中和TNF-α的活性，在体内对TNF-α的活性进行负调节，可去除患者从无症状感染状态进入AIDS的诱因，达到一定的AIDS治疗目的。将TNF-α的单克隆抗体与其他AIDS药物联合用药，拮抗由TNF-α过多所引起的副作用，将会明显提高药效。
1987年，Cerami等人获得一种TNF-α的多克隆鼠抗体(EPO专利出版物0212489，1987年3月4日)，可用于细菌感染引起的休克诊断性免疫测定和治疗。后来又相继获得了TNF-α的单克隆抗体，如Rubin et al.，EPO专利出版0218868，1987年4月22日和Yone等人的EPO专利出版物0288088，1988年10月28日中所描述的。
另外一些研究者描述了对重组人TNF-α特异性的单克隆抗体，在体外具有TNF-α中和活性(Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854，1986；Meager，et al.，Hybridoma 6305-311，1987)。
但是，由于上述研究得到的多为鼠源抗体，这些抗体都存在不同程度的免疫原性高、特异性低和/或稳定性不够等问题，没有提供一种能够在体内发挥诊断或治疗作用。
因此，本领域迫切需要建立既能够保持或提高抗体的亲和力和特异性，又能够降低或基本消除抗体免疫原性的抗TNF-α抗体，从而可以用于临床治疗，比如治疗类风湿关节炎和AIDS等。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异性高、免疫原性低的全人源抗TNF-α单克隆抗体。本发明的单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
本发明所要解决的技术问题还在于提供所述全人源抗TNF-α单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明所要解决的技术问题还在于提供一种含所述全人源抗TNF-α单克隆抗体的药物组合物，它含有本发明的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
本发明所要解决的技术问题还在于提供本发明的单克隆抗体的用途，可用于制备治疗AIDS的药物，并且还可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。
本发明基于噬菌体抗体库技术克隆和表达肿瘤坏死因子抗体，经过筛选获得的抗体是全人源的，克服了目前存在的鼠源抗体免疫原性高的缺点。比之从杂交瘤等获取抗体基因，本发明的全人源抗体制备程序先进简便、价格低廉，更重要的是这种直接从人外周血淋巴细胞中扩增抗体基因的方法，是解决杂交瘤技术等一直无法解决的人源性抗体来源问题的根本途径。
本发明提供了一种全人源的抗TNF-α单克隆抗体，其重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明还提供了全人源的抗TNF-α单克隆抗体的氨基酸序列，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可用于治疗AIDS、类风湿关节炎，还可用于其他需要抑制TNF-α的病症。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
本发明的突出优点在于本发明的单克隆抗体的具有很高的亲和力且是全人源的抗体。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人源性单链抗体(scFv)基因库的构建(1).cDNA的制备收集1000人的外周血各5ml，混合，用淋巴细胞分离液(医科院天津血研所生产)分离单个核细胞。用Invitrogen公司的试剂盒，从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总mRNA。用GIBCO公司的mRNA纯化试剂盒纯化，以上述获得的mRNA为模板，反转录出cDNA第一链。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(2).PCR扩增参照国内外已发表的多种人抗体基因家族序列中V区FR1和FR4较保守的区段序列，设计并合成以下人抗体VH基因(hVH)、VL基因(hVL)、5′端(back)、3′端(forward)引物。根据所用载体pCANTAB5E(一种噬粒，为Pharmacia公司产品)加入适当的限制酶切位点序列(引物均委托上海生工公司进行合成)。
PCR反应以步骤(1)获得的转录cDNA产物为模板，分别以VH引物对或VL引物对进行PCR扩增。在100μl总反应体积中加入4 UTaq酶(购自华美公司)，条件为94℃ 60s，52℃ 70s，72℃ 80s，共30个循环，末次72℃延伸10min。
(3).PCR产物的回收及纯化按照上述条件进行PCR后，将产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳进行鉴定，发现有分子量分别在310bp左右和300bp左右的两条条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收片段，操作按照厂家的说明书进行。
(4).人源性单链抗体(scFv)基因的构建以(Gly4 Ser)3为接头序列(SEQ ID NO5)分别连接VH和VL构成重链-接头序列-轻链结构的ScFv基因。接头引物根据接头序列模板及人抗体V区基因序列3′端、5′端部分序列设计并合成。
以上述接头模板和引物进行PCR扩增及回收、纯化(PCR条件及回收、纯化方法均同上)，分离获得长度约为100bp的接头序列。
实施例2ScFv片段克隆进入噬菌粒载体按照上述条件进行PCR后，获得两端带有SfiI和NotI酶切位点的ScFv片段，进行离心柱层析纯化，去除不必要的接头引物和dNTP。将纯化完毕的ScFv片段用SfiI和NotI(均购自Promega公司)进行双酶切，产生可与载体pCANTAB5E(Pharmacia公司)相连接的粘性末端。再一次进行离心柱层析纯化，去除可能影响其与载体连接的小的SfiI或NotI片段。
噬菌粒载体pCANTAB5E(Pharmacia公司)本身包含有SfiI和NotI酶切粘性末端，可与上述ScFv片段相连接。采用常规的DNA连接酶，将ScFv片段克隆进入噬菌粒载体上相应的位点。在pCANTAB5E载体上其相邻位置是g3p基因，将来可表达ScFv-g3p融合基因。
1升LB培养液加入1ml过夜培养的TG1细胞(Pharmacia公司)，培养至OD值约0.3～0.4，4000rpm离心收集细胞，10倍体积的的冰纯水洗涤两次，重悬于1ml含2％的酵母粉、1％蛋白胨、1mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲液(PH8.0)中。100μ1电击感受态细胞加入连接过夜的DNA样品100ng，电压为10千伏进行电击，将包含ScFv片段的连接载体转染进入E.coli TG1细胞。然后将E.coli细胞培养于SOBAG(含100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的SOB培养基)琼脂板，培养温度为30℃，其中转化有pCANTAB5E载体的Ecoli细胞成活。反复进行电转化，使所获抗体库的容量达到1×1011。
以2×YTAG(含100mg/L氨苄青霉素及2％葡萄糖的2×YT培养基)稀释细菌至OD600＝0.2；再以15ml该悬液培养至对数生长期，加入1011pfu的M13K07辅助噬菌体(购自Promega公司)，37℃振摇培养1h，离心后重悬于10ml 2×YTAK(含100mg/L氨苄青霉素及70μg/ml卡那霉素的2×YT培养基)，摇床培养过夜，于4℃以1500×g离心15min。收集上清即为人源性ScFv噬菌体展示文库。将其分装后于-20℃保存，以备下一步以特异性抗原对文库进行″淘选(panning)″筛选。
实施例3淘选抗体库对于实施例2得到的噬菌体展示文库中的抗体，通过淘选技术选择亲和力高的抗体。
用重组人TNF-α(rhTNF-α)抗原(购自深圳晶美公司)包被酶联板，BSA封闭，温育2h，洗板后加50μl噬菌体抗体库(约1012CFU)温育2 h，TBST(Tris 50mmol/L，NaCl 150mmol/L，Tween-20 0.5％，BSA 1％，pH7.5)液洗1次(第2轮洗5次，第3轮后洗10次，每次5min)，以50μl洗脱液回收噬菌体，中和缓冲液调节pH至中性，感染Ecoli TG1，进行下一轮筛选。共进行3轮筛选，移走没有抗原结合能力的噬菌粒。
进行夹心ELISA实验，测定抗体的抗原结合活性。加入50μl 200ng/ml的重组人TNF-α(rhTNF-α)抗原包被酶联板，BSA封闭，37℃温育1h，加入用PBST(KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO21.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)对倍稀释的噬菌体抗体，37℃孵育2h。洗板，加入HRP标记的羊抗人单抗(购自Pharmacia公司)，37℃ 1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液显色，在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据计算阳性率接近20％，确定其中亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。
将上述挑选出2个亲和力最强的克隆感染E.coli HB2151细胞(Pharmacia公司)，平板培养，从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG(含100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×YT培养液)于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体，进行序列测定，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。
将上述亲和力较强的含scFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5ml LB培养基，过夜培养。加至50ml SBAG(含100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1h，5000rpm离心15min，弃上清。将沉淀重悬于50ml SBAI(含100mg/L氨苄青霉素和1mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3h，离心同上。取沉淀悬于5ml新配制的溶菌酶(1g/L)，20％(w/v)蔗糖，30mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液中，冰浴10min，4℃以12000rpm离心5min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，存贮于-20℃。临用前以0.01mol/L PBS溶解至500μl。
上述获得的单链抗体按照常规方法进行Western印迹试验，结果测得其具有抗原特异性。
实施例4重新克隆到含有人源恒区的表达载体pL101，转化CHO细胞分别设计重链和轻链的引物，在重链引物前端加上XbaI/NheI酶切位点；在轻链引物前端加上HindIII/BsiWI酶切位点，然后以ScFv片段为模板，按常规方法进行PCR，获得带有相应酶切位点的重链可变区片段和轻链可变区片段。
将上述重链可变区插入到表达载体pL101的XbaI/NheI位点中，再用Hind III和Bsi WI将上述抗体轻链可变区插入到插入有重链可变区编码序列的pL101的HindIII/Bsi WI位点中，构建成人源TNF-α抗体的表达载体。表达载体pL101购自Invitrogen公司。
上述构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌DH5α菌株，然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPMI 1641培养基上进行培养，对上清进行Western印迹实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出8个表达较强的克隆作为候选细胞株。
实施例5筛选CHO细胞中的表达强度高的克隆将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10ml的方形细胞瓶中，采用ELISA法测量抗体的表达量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。测得上述8个候选克隆的表达量如下表1抗体基因在CHO细胞中表达强度(mg/l)

从表1可以看出，编号为7B3和2A4的细胞株具有很高的表达水平(250-290毫克/升)，其中7B3的表达量达到了290.7毫克/升。挑选抗体表达量高的克隆，可进行大规模细胞培养并纯化，从而获得大量的全人源的抗TNF-α抗体。
实施例6全人源TNF-α单克隆抗体对于TNF-α的体外中和作用进行ELISA实验，测定全人源TNF-α单克隆抗体对于TNF-α的结合活性。加入50μl 200ng/ml的重组人TNF-α(rhTNF-α)抗原包被酶联板(R&D公司产品)，BSA封闭，37℃温育1h，加入用PBST(KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mol/L，NaCl 137mmol/L，Tween-20 0.5％，pH7.4)对倍稀释的全人源TNF-α单克隆抗体，37℃孵育2h。洗板，加入HRP标记的鼠抗人单抗(购自Pharmacia公司)，37℃ 1h。用1％Tween-20的PBS洗板，加底物液显色，在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据计算，阳性率接近90％，说明全人源TNF-α单克隆抗体对于TNF-α具有很高的亲和力。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(119)<223>抗TNF-α抗体的重链可变区氨基酸序列<400>1Gln Val Lys Ile Glu Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Met Lys Ile Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Leu Phe Ser Asn His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Ile Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ala35 40 45Ala Glu Leu Arg Ser Lys Thr Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Val Glu50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala65 70 75 80Val Leu Leu Gln Pro Ser Asp Leu Arg Thr Glu Asp Ser Gly Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Glu Thr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser115<210>2<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(107)<223>抗TNF-α抗体轻链可变区的氨酰基序列<400>2Asn Ile Ile Leu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Pro Phe Val Gly Ser Ser20 25 30Ile His Trp Tyr Gln Pro Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Ile Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Glu Thr Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Leu Phe Thr Leu Thr Phe Asn Thr Val Glu Thr65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Leu Phe85 90 95Thr Phe Gly Ser Gly Ser Asn Leu Glu Val Lys100 10权利要求
1.一种抗TNF-α单克隆抗体，其特征在于，它是全人源的，其重链可变区具有SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO2所述的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的抗TNF-α单克隆抗体的DNA分子，其特征在于，其重链可变区核苷酸编码SEQ ID NO1所述的序列，轻链可变区核苷酸编码SEQ IDNO2所述的核苷酸序列。
3.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
4.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗AIDS的药物。
5.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗类风湿关节炎的药物。
全文摘要
本发明提供了一种全人源的抗TNF－α单克隆抗体。所述的单克隆抗体具有特异性强，免疫原性低的特点；本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法以及含有所述单克隆抗体的药物组合物。
文档编号A61P29/00GK1613874SQ200310108440
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月6日 优先权日2003年11月6日
发明者陈列平 申请人:上海中信国健药业有限公司