专利名称：一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗病毒天然药物，具体地，涉及一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法。
背景技术：
金丝桃素(Hypericin，HY)是从藤黄科(Clusiaceae)植物贯叶连翘(Hypericum perforatum Linn.)中提取的萘骈二蒽酮化合物，被认为是贯叶连翘提取物中最具生物活性的物质，具有光敏活性和光动作用，可应用于肿瘤的光化学诊断和治疗。金丝桃素除具有抗抑郁、抗肿瘤活性外，还具有抗病毒和增强免疫功能等作用。但是由于金丝桃素对光、热不稳定性，目前市场上金丝桃素有效成分含量极低，远远达不到终端产品开发的要求。纳米药物是指以纳米级高分子纳米粒(nanoparticles，NP)、纳米球 (nanospheres, NS)、纳米囊(nanocapsules，NC)等为载体，与药物以一定方式结合在一起后制成的药物，其粒径可能超过100 nm，但通常应小于500 nm，纳米药物也可以是直接将原料药物加工制成的纳米粒。纳米药物的载药材料要求无毒、生物相容性好、可生物降解。白蛋白不仅具备以上特点，它还具有免疫原性低的特点。另外，白蛋白中的氨基酸以肽键相连接，且扭曲成团状，具网状空隙，为镶嵌携带药物创造了有利条件，与脂质体和乳剂相比，白蛋白纳米粒的体内和贮存稳定性较好。

发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，该方法制得的金丝桃素具有对光、热稳定性好的优点，提高了金丝桃素的有效含量，其粒径在60 nm 150 nm范围内，表面圆整，均勻度好，载药量和包封率高。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案 一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤
(1)将牛血清白蛋白作为载体材料溶于蒸馏水中制成质量浓度为10%-40 %的载体溶
液；
(2)将金丝桃素溶于浓度为95%以上的乙醇制成质量浓度为20%-40 %的油相；
(3)将油相在充分搅拌条件下加入载体溶液中，调节PH至9，滴加助乳化剂充分乳化， 然后滴入戊二醛固化M小时以上，得到固化纳米粒溶液；
(4)15000rpm/min-20000 rpm/min高速离心，弃去上清液，加蒸馏水超声分散，再次高速离心，弃去上清液，用蒸馏水洗涤后收集，真空或冷冻干燥，得到金丝桃素白蛋白纳米粒。具体地，步骤(1)所述牛血清白蛋白与步骤(2)所述金丝桃素质量比为1 :1_8。具体地，步骤(3)所述载体溶液与油相的体积比为5-10 :1。具体地，步骤(3)所述的助乳化剂为浓度高于95 %的乙醇。具体地，步骤(3)所述的戊二醛的质量浓度为2 %-10 %。具体地，步骤(3)所述充分搅拌条件的温度为-10°C -30°C、速度为400rpm/min-1000 rpm/min。具体地，步骤(4)得到的金丝桃素白蛋白纳米粒粒径为60 nm-150 nm，载药量为4 %以上，包封率为70 %以上。本发明提供的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，以牛血清白蛋白作为载体材料包封天然抗病毒药物有效成分金丝桃素，制得金丝桃素白蛋白纳米粒，提高了金丝桃素的有效含量，改善了其对光、热的不稳定性，为金丝桃素及类似的植物有效成分的产品开发提供了一种途径；本发明所研制的金丝桃素白蛋白纳米粒，由于其粒径小，易于通过机体屏障，另外，它还具有免疫系统被动靶向作用，易于药物在免疫系统的聚集。因此，相对于目前国内市场上金丝桃素的其它剂型，如粉剂，注射剂等，此纳米粒在很大程度上提高了金丝桃素的生物利用度，制得的金丝桃素白蛋白纳米粒的粒径在60 nm 150 nm范围内，表面圆整，均勻度好，载药量和包封率高。


附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中
图1是本发明实施例一制备的金丝桃素白蛋白纳米粒的透射电镜图； 图2是本发明实施例一制备的金丝桃素白蛋白纳米粒的粒径分析图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1
精确称取白蛋白2.0 g溶于98 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml 无水乙醇中制成油相，在室温-10°C 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min), 将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以0.5 ml/min滴加20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3次， 冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为120 nm，载药量4. 12 %，包封率71. 43 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于日光灯下，分别于第0天，第 3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降25. 43%，第5天 34. 02%，第7天下降43. 76%，金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降3. 45%，第 5天下降5. 83%,第7天下降7. 38%ο如图1所示，图1是本发明实施例一制备的金丝桃素白蛋白纳米粒的透射电镜图， 在图中，金丝桃素白蛋白纳米粒的粒径在60 nm 150 nm范围内，表面圆整，均勻度好范围内，表面圆整，均勻度好。如图2所示，图2是本发明实施例一制备的金丝桃素白蛋白纳米粒的粒径分析图， 在图中，金丝桃素白蛋白纳米粒的粒径主要集中在130 nm左右。实施例2
精确称取白蛋白2.0 g溶于98 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml 无水乙醇中制成油相，在室温-10°C 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min),将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以1.0 ml/min滴加 20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3 次，冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为60 11!11，载药量434 %， 包封率74. 78 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于日光灯下，分别于第0天， 第3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降26. 17%，第5 天33. 57%，第7天下降40. 86%，金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降4. 45%， 第5天下降5. 79%，第7天下降7. 40%。实施例3
精确称取白蛋白2.0 g溶于98 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml 无水乙醇中制成油相，在室温-10°C 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min), 将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以2.0 ml/min滴加20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3次， 冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为100 nm，载药量4. 23 %，包封率72. 39 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于日光灯下，分别于第0天，第 3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降26. 43%，第5天 36. 12%，第7天下降41. 75%，金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降3. 73%，第 5天下降6. 13%,第7天下降8. 24%ο实施例4
精确称取白蛋白4.0 g溶于96 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml 无水乙醇中制成油相，在室温-10°C 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min), 将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以0.5 ml/min滴加20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3次， 冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为140 nm，载药量4. 57 %，包封率79. 07 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于40士2°C恒温培养箱下，相对湿度为75%，分别于第0天，第3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降15. 44%，第5天23. 14%，第7天下降34. 36%，金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降4. 13%，第5天下降5. 43%，第7天下降7. 20%。实施例5
精确称取白蛋白4.0 g溶于96 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml 无水乙醇中制成油相，在室温-10°C 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min), 将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以0. 5 ml/min滴加 20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3 次，冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为70 nm，载药量5. 21 %， 包封率76. 98 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于40士2°C恒温培养箱下，相对湿度为75%，分别于第0天，第3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降16. 63%，第5天22. 38%，第7天下降32. 31%，金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降4. 53%，第5天下降4. 98%，第7天下降6. 21%。实施例6
精确称取白蛋白4.0 g溶于96 ml蒸馏水中制成载体溶液，称取HY 4.0 g溶于96 ml无水乙醇中制成油相，在室温-10°c 30°C，搅拌条件下(400 rpm/min 1000 rpm/min), 将油相5 ml滴加到50 ml载体溶液中，调充分乳化并调节PH=9，继续以0.5 ml/min滴加20 ml无水乙醇，充分搅拌2 h，戊二醛固化M h，15000 rpm/min高速离心15 min，洗涤3次， 冷冻干燥，收集，得到乳白色金丝桃素白蛋白纳米粒，平均粒径为150 nm，载药量4. 67 %，包封率74. 31 %。将制备的金丝桃素白蛋白与普通金丝桃素置于40士2°C恒温培养箱下，相对湿度为75%，分别于第0天，第3天，第5天，第7天测定其含量，结果发现，普通金丝桃素含量第3天下降17. 71%，第5天62%，第7天下降36. 40%,金丝桃素白蛋白纳米粒中金丝桃素含量第3天下降5. 14%，第5天下降6. 81%，第7天下降7. 67%。 最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将牛血清白蛋白作为载体材料溶于蒸馏水中制成质量浓度为10%-40 %的载体溶液；(2)将金丝桃素溶于浓度为95%以上的乙醇制成质量浓度为20%-40 %的油相；(3)将油相在充分搅拌条件下加入载体溶液中，调节PH至9，滴加助乳化剂充分乳化， 然后滴入戊二醛固化M小时以上，得到固化纳米粒溶液；(4)15000rpm/min-20000 rpm/min高速离心，弃去上清液，加蒸馏水超声分散，再次高速离心，弃去上清液，用蒸馏水洗涤后收集，真空或冷冻干燥，得到金丝桃素白蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述牛血清白蛋白与步骤(2)所述金丝桃素质量比为1 :1-8。
3.根据权利要求1所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述载体溶液与油相的体积比为5-10 :1。
4.根据权利要求1所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的助乳化剂为浓度高于95 %的乙醇。
5.根据权利要求1所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的戊二醛的质量浓度为2 %-10 %。
6.根据权利要求1所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述充分搅拌条件的温度为-10°C _30°C、速度为400rpm/min-1000 rpm/min。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)得到的金丝桃素白蛋白纳米粒粒径为60 nm-150 nm，载药量为4 %以上，包封率为70 %以上。
全文摘要
本发明公开了一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法，包括(1)将牛血清白蛋白作为载体材料溶于蒸馏水中制成质量浓度为10%-40%的载体溶液；(2)将金丝桃素溶于浓度为95%以上的乙醇制成质量浓度为20%-40%的油相；(3)将油相在充分搅拌条件下加入载体溶液中，调节pH至9，滴加助乳化剂充分乳化，然后滴入戊二醛固化24小时以上，得到固化纳米粒溶液；(4)15000rpm/min-20000rpm/min高速离心，弃去上清液，加蒸馏水超声分散，再次高速离心，弃去上清液，用蒸馏水洗涤后收集，真空或冷冻干燥，得到金丝桃素白蛋白纳米粒。本发明制得的产品对光、热稳定性好，提高了金丝桃素的有效含量。
文档编号A61K9/14GK102525937SQ20121002021
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月21日 优先权日2012年1月21日
发明者刘宇, 华兰英, 尚若峰, 梁剑平, 王学红, 胡小艳, 赫宝成, 陶蕾 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所