专利名称：：繁缕总糖肽与总黄酮成份的组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：在本发明人的公开号为CN1377680A和CN1498630A两发明专利基础上，本次发明公开了对上述两专利中的组合物化学成份进行深入研究的进展和结果，涉及从植物繁缕或从其它一种繁缕属植物提取的分子量分布在1,000100,000、一类呈深棕黄色粉末的总糖肽与总黄酮的组合物作为一种更安全、更高效的广谱抗病毒天然药物应用。二
背景技术：
：经检索美国《化学文摘》(ChemicalAbstracts)从1920年起至2001年第134巻为止，所报道的繁缕属植物的化学成分主要是黄酮及黄酮甙类、皂甙及皂甙原类、环縮氨酸类、阿魏酸及其酯类、绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、奎宁酸、抗坏血酸类、草酸及草酸钙、单酰基半乳糖类脂物、生物碱类、吡喃半乳糖-SN-丙三氧基类、菠菜甾醇、豆甾烯醇、谷甾醇类等等。本发明人曾在公开号为CN1377680A专利中公开了从繁缕属植物繁缕或其它一种繁缕属植物中提取的分子结构中含较多硫元素和钙元素的总有机酚酸及其糖苷类化合物以及在CN1498630A号专利中公开了根据组合物为在270.1nm和326.6nm处有两个最大吸收峰的分子结构中有桂皮酰和苯甲酰结构的黄酮类大极性化合物的组合物作为抗病毒药物的应用，且该组合物与三氯化铁试液显茶色反应等特点。另有公开号CN1521193A的专利称其用热低级醇从繁缕属植物中提取到分子量分布在40002000000并含肽和羧基的灰白色多糖类成份和公开号为CN1521179A的专利公开了用醇提水醇沉法得到的繁缕中总黄酮抗疱疹病毒和艾滋病毒的应用。但至今尚未见从植物繁缕或从其它一种繁缕属植物提取的分子量分布在1,000100,000、一类呈深棕黄色粉末的总糖肽与总黄酮的组合物作为广谱抗病毒药物应用的报道。三
发明内容1、本发明要解决的技术问题提供一种从繁缕或其它一种繁缕属植物提取分离的分子量分布在1,000100,000、一类总糖肽与总黄酮的组合物作为更安全、更高效的广谱抗病毒药物应用。2、本发明采用的技术方案在本发明人已经公开的CN1377680A及CN1498630A两份专利基础上，对原专利的组合物中抗病毒有效成份进行进一步深入研究，探究其分子量分布范围和化学组成，得到新的有效成份组合物具有更安全、更高效的广谱抗病毒药物作用，从而作为一种更好的抗病毒药物应用。3、经在高效液相色谱仪的凝胶柱上用缓冲液洗脱，用葡聚糖P-82作标准品，通过GPC软件进行分子量分布测得从繁缕及其它一种繁缕属植物中提取分离到的高效广谱抗病毒组合物是分子量分布在1,000100,000、一类总糖肽与总黄酮的组合物。该总糖肽与总黄酮的组合物中的总肽中包括有环亮氨酸异亮氨酸二肽和环缬氨酸一酪氨酸二肽在内的环肽.总肽部份占该组合物的15%25%，总肽经水解至少可测得以下19种氨基酸，各氨基酸的含量比例分别为天门冬氨酸12.118%13.18%、谷氨酸13,036%18.425%、丝氨酸4.156%6.19%、组氨酸1.89%1.946%、甘氨酸8.909%9.915%、苏氨酸4.837%7.129%、精氨酸2.92%3.677%、丙氨酸6.05%9.647%、酪氨酸2.596%2.877%、胱氨酸0.2%1.89%、缬氨酸5.94%7.577%、蛋氨酸0.2%2.09%、苯丙氨酸2.74%3.738%、异亮氨酸4.28%5.046%、亮氨酸4.70%5.53%、赖氨酸5.77%7.965%、脯氨酸4.61%8.60%、Y-氨基丁酸:1.25%1.75%及a-氨基-Y-羟基-戊二酸1.04%1.77%;由于供试样品和测定条件的不同，有时有些氨基酸未测出，或测出有环亮氨酸异亮氨酸二肽和环缬氨酸一酪氨酸二肽在内的环肽；该组合物所含的糖包括葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖，经苯酚-浓硫酸法测得总糖在组合物中占15%30%，与苯酚-浓硫酸反应呈现糖的棕黄色反应并在400nm410nm和480nm4卯nm出现两个最大吸收峰，其中400nm410nm的峰为主峰要比480nm490nm出现的吸收峰高一倍是其鉴别的重要特征；该组合物中的总黄酮类占10%40%，主要为芹菜素及其苷类，包括芹菜素、芹菜素-6，8_二-C-0-D-吡喃葡萄糖苷，即新西兰牡荆苷-2、芹菜素-6-C-P-D--葡萄糖-8-C-15-D-半乳糖苷、芹菜素-6-C-P-D-半乳糖-8-C-P-D-葡萄糖苷、芹菜素-6，8-二-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-P-D-葡萄糖-8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-a-L-阿拉伯糖-8-C-e-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-P-D-半乳糖-8-C-ci-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-C-e-D-半乳糖苷、芹菜素-8-C-葡萄糖苷，即牡荆素、开菜素-6-C-3-D-葡萄糖苷，即异牡荆素、麦黄酮-6，8-二-C-e-D-葡萄糖苷、麦黄酮-6-C-a-L-阿拉伯糖-8-C-D-葡萄糖苷、7-0-{3-D-葡萄糖基-6-C-0-D-葡萄糖(6〃-乙酰基)芹菜素。组合物中除氨基酸、糖和黄酮以外的烷烃或/和包括醇类在内的含氧烷烃部份占25%40%;该总糖肽与总黄酮结构中所含硫元素占14%，除胱氨酸、蛋氨酸等所含硫外，硫还形成硫酸酯多糖，或/和巯基或/和硫醚或/和硫醇或/和硫一硫结构；该组合物与三氯化铁试液显现酚类的一种深绿茶色反应，并在220nm235nm处和330nm350nm处出现两个最大吸收峰，其中220nm235nm峰是主峰，要比330nm350nm的峰高出一倍是其鉴别的另一个重要特征；组合物呈棕色粉末状，略有苦味，易溶于水呈棕红色溶液。组合物根据其中总糖肽与总黄酮二者含量和浓度的不同形成棕红色、深棕红色或近棕黑色透明溶液，该总糖肽分子量越大、含量越高，而黄酮含量越低其溶液色泽越趋向近深棕黑色仍至近黑色、其抗病毒作用也越强。4、本发明所述的组合物，是从下列一种植物中提取，这些植物包括了繁缕属植物StellariaL.及牛繁缕属植物MalachiumFries的以下79禾中，即繁缕Stellariamedia(L.)Cyr.、雀舌草StellariaalsineGrimm.、褐瓣雀舌草Stellariaalsinevar.phaeuspetalaHand.-Mazz.、安t敦繁缕StellariaanhwiensisMigo.、钝萼繁缕StellariaamblyosepalaSchrenk.、细尖繁纟娄StellariaapiculataWils.、我鸟月汤草Stellariaaquatica(L)Scop.、沙、生繁纟娄StellariaarenariaMaxim、N"里山繁纟娄StellariaarisanensisHayata.、薄卩十阿里山繁缕Stellariaarisanensisvar.leptophyllaHayata.、北繁缕StellariaborealisBigel.、短瓣繁缕StellariabrachypetalaBge.、长瓣繁缕StellariabungeanaFenzl.、东北繁缕Stellariacherleriae(Fisch.)Will,、华繁缕StellariachinensisRegel、台湾繁缕StellariacicranthaHayata、厚叶繁缕StellariacrassifoliaEhrh.、刍皮叶繁缕StellariacrispateWall.、大卫繁缕StellariadavidiiHemsl.、f匿臣卜繁缕StellariadecumbensEdgew.、tH犬〈匮臣卜繁纟娄Stellariadecunbensvar.aciculariaEdgew.etHook.f.、西南繁缕StellariadelavayiFranch.、石竹卩十繁缕StellariadianthifoliaWilliams、二歧聚伞花繁缕StellariadichasioidesWilliams、双歧繁缕StellariadichotomaL.、窄卩十双歧繁缕Stellariadichotomavar.lanceolataBge.、线叶双歧繁缕Stellariadichotomavar.stephenianaWilld.、铺散繁缕StellariadiffusaWills.、翻白繁缕StellariadiscolorTurcz.、泽繁缕StellariadiversifloraMaxim.、丰果^l异花繁纟娄Stellariadiversifloravar.gymnandraFranch.、凹I7I(繁纟娄StellariadepressaSchnid.、杜氏繁缕StellariaduthieiGandoger、线茎繁缕StellariafilicaulisMak.、线柄繁缕StellariafilipesKomar.、多花繁缕StellariafloridaFisch.、未叶繁缕StellariagramineaL.、疏柔毛禾叶繁缕Stellariagramineavar.pilosulaMaxim.、变绿禾叶繁缕Stellariagramineavar.viridescensMaxim.、江孜繁缕StellariagyantsensisWilliams、霞草繁缕StellariagypsophiloidesFenzl.、湖北繁纟娄StellariahenryiWilliams、兴安繁缕StellariahsinganensisKitagawa、内曲繁缕StellariainfractaMaxim.、薄叶繁缕StellarialeptophyllaHance、东繁缕StellariamaximowixzianaFranch.、繁缕Stellariamedia(L.)Cyr.、小花繁缕StellariamicranthaHayata、柔繁缕StellariamitansWilliams、我鸟肠繁缕StellarianeglectaWeihe、新沼生繁缕Stellarianeo-palustrisKitagawa、八蓝繁缕StellariaoctandraFobedim.、纟工莓繁缕StellariaoxycoccoidesKomar.、》召生繁纟娄StellariapalustrisL.、展口十繁缕StellariapatentifoliaKitagawa、柄花繁缕StellariapeduncularisBge.、柄叶繁缕StellariapetiolarisHand-Mazz.、长毛繁缕StellariapilosaFranch.、假石生繁缕StellariapseudosaxatilisHand.-Mass.、小繁缕StellariapusillaSchmid.、燧瓣繁缕StellariaradiansL.、网脉繁缕StellariareticulivenaHayata、岩繁缕StellariampestrisHemsl.、石生繁纟娄StellariasaxatilisBuch.-Ham.、抱茎石生.繁纟娄Stellariasaxatilisvar.amplexicaulisHand.陽Mazz.、准葛尔繁缕StellariasoongoricaRoshev.、苏氏繁缕StellariasoulieiWilliams、星毛繁缕Stellariastellato-pilosaHayata、园萼繁缕StellariastrongylosepalaHand,Mazz.、拟伞花繁缕StellariasubumbellataEdgew.、小茸毛繁缕StellariatomentellaOhwi、三型繁缕StellariatrimorphaNakai、土耳其斯坦繁缕StellariaturkestanicaSchischk.、湿地繁缕StellariaudaWilliams、伞花繁缕StellariaumbellataTurcz.、绿花繁缕StellariavirdifloraPaxetO.Hoffm.、巫山繁缕StellariawushanensisWilliams、五台繁缕StellariawutaicaHand.-Mazz.、云南繁纟娄Stellariayunnanensisfranchj或牛繁缕属t直物牛繁纟娄Malachiumaquaticum(L.)Fries等。5、本发明还提供用水提取醇沉淀再经超滤的提取制备组合物的方法及加温改善树脂柱上洗脱条件后提高组合物得率的方法，并用较低浓度的低级醇类洗脱组合物以提高组合物中总糖肽含量、减少其中黄酮类成份的含量，增强组合物的抗病毒作用，降低毒副作用和刺激性及生产成本。6、组合物具有以下有益效果组合物可抗病毒包括艾滋病毒、肝炎病毒、包括高致病性禽流感病毒在内的流感病毒、副流感病毒、腺病毒等呼吸道病毒及尖锐湿疣病毒、肠病毒、腮腺炎病毒、单纯性疱疹病毒、带状疱疹病毒和水痘一带状疱疹病毒等，并且较本发明人已经公开的CN1377680A及CN1498630A两份专利中发明的组合物中具有更高含量的总糖肽并降低黄酮类成份含量，因而组合物具有更强的抗病毒作用及更低的毒副作用或刺激性。具体实施例方式一)、组合物的制备方法包括下列三种1、其制备方法l，其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的生药或鲜草折算成干草，粉碎后用水提取得到水溶液经沉淀、离心或过滤后通过预先已处理好的大孔树脂柱以吸附所述组合物的成份，用水洗净大孔树脂柱，再将大孔树脂柱加温至45。C55"C后用同样温度的热蒸馏水洗柱并收集流出的深褐色蒸馏水液，继用加温至45"C55"、浓度在5%35%的低级醇类或丙酮从树脂柱上洗脱，收集洗脱得到的棕红色或暗棕红色醇液或丙酮液，将此溶液回收醇或丙酮后与收集的深褐色水液合并，浓縮至比重达0.80至1.00后静置12小时，离心去除杂质，经6(TC真空干燥或喷雾干燥即得组合物粗品，组合物粗品中总糖肽与总黄酮与黄酮类成份的比例为55%:45%;如将组合物粗品再用纯水溶解成比重0.801.10的溶液后加浓度为95%的乙醇使溶液中醇或丙酮浓度达到50%70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤一次、2倍体积量的丙酮洗涤一次，经6(TC真空干燥或加水溶解成比重为1.00L20的溶液再喷雾干燥即得组合物，该组合物中总糖肽与总黄酮与黄酮类成份的比例为90%:10%;其中低级醇类包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。2、权利要求1所述组合物的制备方法2,其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的鲜草或鲜干草洗净、粉碎后提取水溶液，将此水溶液经沉淀、离心或过滤后得到液体；将此液体经阴离子交换剂柱将所述组合物成份吸附在柱上，用2N氯化钠溶液将所述组合物成份从柱上洗脱下来，再经脱盐处理、浓縮至比重达0.80至1.00后静置12小时，离心去除杂质，加浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇浓度达到50%70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤12次、2倍体积量的丙酮洗涤12次，经60。C真空干燥或加水溶解成比重为1.101.20的溶液再6(TC真空干燥或喷雾干燥即得组合物；其中阴离子交换剂柱包括弱阴离子交换树脂柱和阴离子交换纤维素柱。3、权利要求1所述组合物的制备方法3，其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的干药材粉碎后，用510倍体积的水浸提两次，每次13小时，合并提取得到的深棕色提取液，减压浓縮至比重0.70.9,静置12小时，滤除沉淀，溶液中加入95%低级醇类或丙酮使浓度达60%70%，静置12小时，滤集析出的沉淀物即得组合物粗品，将此组合物粗品用适量纯水溶解后经高速离心机15,000rpm，离心15分钟，离心后的澄清液先经孔径为0.22um的陶瓷膜处理设备精滤处理，再经切割分子量为2000以上的超滤膜超滤，将经超滤去除部分小分子量杂质后的溶液浓縮至比重0.70.9，加入低级醇或丙酮使浓度达85%进行二次醇沉，静置12小时后吸出上层清液，将沉淀物经减压抽滤近干，及时先后加适量无水乙醇和丙酮洗涤，抽滤至干，并立即经6(TC真空干燥即得较纯的粉末状组合物；其中低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇。4、组合物作为抗病毒药物应用至少可做成以下剂型1).针剂，可用于治疗艾滋病、肝炎、SAS病毒引发的非典型肺炎、高致病性禽流感病毒H5N,型等引发的各种病毒性疾病。2).粉针剂，可用于治疗艾滋病、肝炎、SAS病毒引发的非典型肺炎、高致病性禽流感病毒HsN,型等引发的各种病毒性疾病。3).气雾剂，用于小儿治疗流感、腮腺炎等，并可作为空气及口腔抗病毒的消毒剂、保健品或抗病毒功能性食品。4).含片或咀嚼片，用于治疗腮腺炎等，可作为空气及口腔抗病毒的消毒剂、保健品或抗病毒功能性食品。5).胶囊剂，口服用于治疗艾滋病、肝炎、流感等各种病毒性疾病。6).滴丸、微丸、微囊剂等，用以治疗艾滋病、肝炎等慢性病毒疾病。7).滴鼻剂或鼻喷剂，用于治疗流感等，还可作为鼻腔抗病毒的消毒剂、保健品等，也可通过雾化器雾化吸入给药，用以治疗治疗病毒性肺炎，如SAS病毒引发的非典型肺炎、高致病性禽流感病毒H5N,型引发的病毒性疾病等。8).膜剂或涂剂等，用于疱疹、尖锐湿疣等皮肤病的治疗。9).胶浆剂，用于治疗疱疹等皮肤病。10).水剂，用于临床直接涂抹治疗疱疹、尖锐湿疣等皮肤病。11).液体口香糖，可作为口腔抗病毒消毒剂、抗病毒保健品或功能性食品。12).口香糖，可作为口腔抗病毒消毒剂、抗病毒保健品或功能性食品等。二)、组合物的实施例1、用第一种方法的实施例l:取拣净杂质的繁缕干鲜草5kg折算称干草后加812倍的水提取，离心、过滤，提取得药液，将此药液通过id30cmX120cm的市售大孔树脂柱，控制流速在5ml/min。可见大孔树脂柱由上而下逐渐变成一种棕红色或深棕褐色直至柱子吸满药物。弃去柱子中流出的液体，并先用自来水洗净柱中的残液。用约2倍柱体积的55t:蒸馏水洗涤大孔树脂柱，弃去最先流出的无色及色泽较浅淡的水液，收集随后流出的深褐色水液。此时大孔树脂柱已被加温至45°C50°C，继用55。C约为柱体积3倍量的35%乙醇洗脱并收集棕红色乙醇溶液，本例用量约为300L35。/o的乙醇；将收集的棕红色乙醇溶液经减压浓縮回收乙醇，所得浓縮液与收集到的深褐色水液合并浓縮至比重0.80，约为1010ml左右，静置过夜，然后以4000r/min离心5分钟，弃去沉淀物，上清液经0.5um滤膜过滤于己灭菌的洁净容器中，量取其中的一半经浓縮至比重1.10后，于6(TC真空干燥得粗品1，并测得其中总糖肽与总黄酮与黄酮之比为55%:45%;其余一半溶液再在无菌条件下经减压浓縮成比重为l.OO的稠膏状，再静置12小时，离心去除杂质，加浓度为95%的乙醇使溶液中醇浓度达到70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤一次、2倍体积量的丙酮洗涤一次，经6(TC真空干燥即得粗品2，并测得其中总糖肽与总黄酮与黄酮之比为90%:10%，计得50.38g，得率按鲜草计算为8.91%。，反复用此法共制得组合物606g，将此粗品2进一步用乙醇洗涤除尽黄酮类化合物时及可得到本发明的组合物。2、用第二种方法的实施例2:取繁缕鲜草32kg，用自来水洗净泥土后粉碎，用水提取药液；将药液经过沉淀、离心或过滤后即得到液体，将此液体通过id10cmX120cm的市售阴离子交换树脂柱，吸附所述组合物成份后，用约为柱体积3倍的新鲜蒸馏水或去离子水洗净弱碱性阴离子交换树脂柱，弃去从柱中流出的由浅黄色逐渐变淡直至几乎无色的洗柱液，本例用量约为30L水；然后将树脂柱加温至45。C5(TC继用2倍于柱体积的并加热到约55。C的浓度为2N的NaCl溶液将吸附在柱上的所述组合物成份迅速洗脱并收集此深棕红色洗脱液，本例用NaCl溶液量为20L。将此含盐溶液适当浓縮至750ml左右后置于半透膜袋中，先后对自来水和蒸馏水进行透析直至溶液对AgN03溶液反应很弱或无咸味为止；将透析后所得深棕红色溶液转移至减压干燥器中减压干燥至比重0.90呈粘稠状，约为400ml，静置过夜，然后以4000r/min离心5分钟弃去沉淀物；加浓度为95%乙醇使溶液中乙醇浓度达到70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤12次、2倍体积量的丙酮洗涤12次，经6CTC真空干燥得棕色组合物粉末，有一般的中药气味，共得31.14g，得率按鲜草计算约为0.973%。，用此法共制得精制品512.73g。3、用第三种方法的实施例3:取植物繁缕鲜干草5kg洗净、粉碎后，用水15kg、15kg提取两次，合并所得水溶液，将此水溶液经沉淀、离心或过滤后得到液体；将此液体经减压浓縮至比重为0.8左右，加入95%乙醇，使乙醇的浓度达到75%，溶液即出现大量浑浊，静置12小时过夜，吸出上层清液弃去，将下层沉淀物经离心或过滤得组合物粗品，将此粗品再用400ml纯水溶解后经高速离心机15，000r/min，离心15分钟，将离心后的澄清液先经孔径为0.22um的陶瓷膜处理设备精滤处理，再经切割分子量为2000以上的超滤膜超滤，将经超滤去除部分小分子量杂质后的溶液浓縮至比重0.85，加入95%乙醇使达85%浓度进行二次醇沉，静置12小时左右吸出上层清液，将沉淀物经减压抽滤近干，及时先后加无水乙醇350ml和丙酮350ml洗涤，抽滤至干，并立即经6(TC真空干燥即得较纯的棕色粉末状组合物55.29g，得率为1.1%，用此法共制得465g。表l.给出从大孔树脂柱上洗脱组合物时，温度变化对得率的影响表].实施例1中从柱上洗脱组合物时温度变化对得率的影响，号______________________整—______________—药物色泽—得率(鲜草计)备^<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4、分子量分布测定将组合物用水溶解，在高效液相色谱仪上进样，用曰本产葡聚糖凝胶柱经0.1%磷酸钠缓冲液洗脱，以分子量为64,000的牛血清白蛋白、分子量为12,000道尔顿的细胞色素C及分子量为1,400道尔顿的短杆菌肽为参照标准品，通过GPC软件进行分子量分布测定得从繁缕中提取分离到的总糖肽与总黄酮组合物其分子量分布在1,000100,000。5、组合物样品中的总肽经水解后的氨基酸含量测定:取组合物供试样品0.2g加6NHC1于120。C封管水解20个小时，中和后定容，取上清液用标准氨基酸为对照测得组合物样品中所含的总肽共计可水解出以下19种氨基酸，根据供试样品中总糖肽与总黄酮比例的不同及在不同条件下测得总肽含量为15%25%，各个氨基酸占总肽的含量分别为天门冬氨酸12.118%13.18%、谷氨酸13馬％18.425%、丝氨酸4.156%6.19%、组氮酸1.89%1.946%、甘氨酸8.909%9.915%、苏氨酸4.837%7.129%、精氨酸2.92%3.677%、丙氨酸6.05%9.647%、酪氨酸2.596%2.877%、胱氨酸0.2%1.89%、缬氨酸5.94%7.577%、蛋氨酸0.2%2.09%、苯丙氨酸2.74%3.738%、异亮氨酸4.28%5.046%、亮氨酸4.70%5.53%、赖氨酸5.77%7.965%、脯氨酸4.61%8.60%、Y-氨基丁酸:1.25%1.75%及a-氨基-Y-羟基-戊二酸1.04%1.77%,由于供试样品和测定条件的不同，有时有些氨基酸未测出，或测出有环亮氨酸异亮氨酸二肽和环缬氨酸一酪氨酸二肽在内的环肽；此组合物的酸水解液中还检测出有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。该组合物中的总黄酮类占10%40%，从总黄酮中分离鉴定出的黄酮主要为芹菜素及其苷类，包括芹菜素、芹菜素-6，8-二-C-0-D-吡喃葡萄糖苷，即新西兰牡荆苷-2、芹菜素-6-C--葡萄糖-8-C-p-D-半乳糖苷、芹菜素-6-C-D-半乳糖-8-C-P-D-葡萄糖苷、芹菜素-6，8_二-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6--C--D-葡萄糖-8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素_6-C_a-L-阿拉伯糖-8-C-P-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-P-D-半乳糖-8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-C-e-D-半乳糖苷、芹菜素-8-C-e-D-葡萄糖苷，即牡荆素、芹菜素-6-C-葡萄糖苷，即异牡荆素、麦黄酮-6，8-二-C-3-D-葡萄糖苷、麦黄酮-6-C-a-L-阿拉伯糖-8-C-e-D-葡萄糖苷、7-0-3-D-葡萄糖基-6-C-P-D-葡萄糖(6〃-乙酰基)芹菜素。总糖肽与总黄酮结构中所含硫元素占14%，除胱氨酸、蛋氨酸等所含硫外，硫还形成硫酸酯多糖，或/和巯基或/和硫醚或/和硫醇或/和硫-硫结构，其红外光谱测试取组合物少量用KBr压片，在红外扫描仪上在WOOcm-LAOOcm-1波数范围进行扫描，其红外扫描图谱中可见1236.94cm—1的波数峰，表明有OS03的SO伸縮振动，838.14cm—1的波数峰表明有C-O-S的拉伸振动，这是硫酯键的特征峰，表明该含硫总糖肽类的酚性成份的组合物中具有硫酸酯结构；其中O-S是硫醚结构、s=o是巯基结构，红外扫描图谱中还可见硫醇或/和硫-硫结构。6、组合物的酚显色反应取少量组合物用纯水溶解，滴加2滴2NHC1使呈酸性，滴加1%三氯化铁试液两滴即显现一种酚类的深绿茶色反应，经日本岛津产UV-2401PC紫外-可见光光谱仪扫描，扫描范围200nm-900nm，可见在220nm235nm处和330nm350nm处出现两个最大吸收峰，其中220nm235nm峰是主峰，要比330nm350nm的峰高出一倍是其鉴别特征之一。7、组合物中总多糖的苯酚-浓硫酸显色反应及测试取少量组合物用纯水lml溶解，滴加2滴新鲜配制的5%苯酚试剂，迅速冲入5ml浓硫酸即呈现糖的棕黄色，再在沸水中15min，冷却后经日本岛津产UV-2401PC紫外-可见光光谱仪扫描，扫描范围200nm-900nm，可见在400nm410nm禾n480nm490nm出现两个最大吸收峰，其中400nm410nm的峰为主峰要比480nm490nm出现的吸收峰高约一倍；经用葡萄糖标准品为对照、在485nm处测试测得总糖含量为15%30%。8、组合物所做核磁共振氢谱中可见其组合物中非糖的烷烃或/和含氧烷烃部份占25%40%。9、各种剂型的制备实施例如下9丄针剂将实施例提取分离得到的药物精制品200g用0.9%氯化钠注射液2000ml溶解后用离心机离心5分钟(4000r/min)，将离心后所得上层清液经0.5um滤膜密封过滤于已灭菌的洁净容器中，经灌封机灌装于注射剂用安瓿中，视需要分别分装成lml/支的IOOO支、O.lg/支，2ml/支的450支、0.2g/支，再经钴60照射灭菌即得注射剂。9.2.粉针剂将实施例提取分离得到的药物精制品200g用蒸馏水50ml溶解后经离心机离心5分钟(4000r/min)，将离心后所得上层清液经0.5um滤膜密封过滤于已灭菌的洁净容器中，经喷雾干燥机喷干成药粉，再经灌封机灌封在安瓿中，再经钴60照射灭菌即可制成2ml的粉针剂，共计2000支，100mg/支。使用时用灭菌注射用水溶解后使用。9.3.气雾剂取4g药物精制品加入0.9。/。氯化钠注射液100ml溶解、离心、过滤于洁净的10ml装气雾剂瓶中，即制成10支气雾剂，200mg/支。可作为口腔抗病毒的消毒剂。9.4.含片剂取按实施例l制得的药物精制品100g与片剂的敷料、香料、矫味剂等一起用压片机制成含片2000片，50mg/片。可作为口腔抗病毒的消毒剂、保健食品或抗病毒功能性食品。9.5.胶囊剂取按实施例1制得的药物真空干燥后研成粉状的精制品100g在无菌条件下，灌装成1000粒胶囊，100mg/胶囊。可用于治疗各种病毒病，还可作为口腔抗病毒的消毒剂、保健食品或抗病毒功能性食品。9.6.微囊剂取按实施例1制得的经过精制处理的药物干粉3g使混悬于3.6g液状石蜡中；再另取阿拉百胶10g加入蒸馏水200ml，待溶解后煮沸半小时以破坏氧化酶，将温热的液状石蜡注入阿拉百胶液中，于组织捣碎机中乳化12分钟，制成水包油乳剂。再取明胶10g加入蒸馏水200ml，置于6(TC水浴上溶解，并与上述阿拉百胶液混合于1000ml烧杯中，维持胶液在45。C5(TC，慢速搅拌。用新鲜配制的5%醋酸溶液5ml加至胶液中，调节溶液的PH值至约为4.1，产生凝聚作用。成囊后注入蒸馏水750ml，再移至冰浴中冷却，降温至5l(TC，使明胶囊膜冻凝。这时的微囊呈球状。再加37%的甲醛7ml进行固化。搅拌15分钟，使微囊定型。然后用20%的氢氧化钠溶液调节囊液至PH8.0左右。于低温搅拌l小时后，用离心机滤过，洗涤至中性无甲醛味。再加入囊重3%的硬脂酸镁作稀释剂，混合均匀后过16目筛，再5(TC真空干燥，得此药物的微囊剂，得率72.2%，计16.6g微囊，i80mg/g。另外还可制成微丸、滴丸等。9.7.滴鼻剂将按实施例1提取分离得到的药物精制品2g用0.9%氯化钠注射液100ml溶解后用离心机离心5分钟(4000r/min)，将离心后所得上层清液经0.5iim滤膜密封过滤于已灭菌的洁净塑料眼药水瓶中分装成10支滴鼻剂，200mg/支。9.8.膜剂取按实施例1制得的药物精制品30g、氮酮0.3ml加水100ml溶解后离心、经0.5um滤膜过滤于洁净容器内，加入PVA(05-88)19.5g适当加热搅拌使其溶解，洁净条件下在平板玻璃上涂成宽100mm、长约100mm、厚约O.lmm的药膜。再将宽约100mm、长100mm、厚约0.05mm的避光包衣薄膜在药膜上下两面各覆一层作为包衣膜，然后封装成膜剂。其剂量为0.3g/cm2，临用时按需要及其剂量剪切使用。9.9.胶浆剂取白芨胶质(中等粉)2g分装于IO个15ml的干燥玻璃瓶中，各加入甘油2ml作分散剂，振摇分散均匀后，另取氯仿水100ml加入3g药物精制品搅拌使其溶解，离心后经0.5um滤膜分别过滤于分散均匀的白芨胶质玻璃瓶中，猛烈振摇，得药物胶浆剂，200mg/瓶。9.10.水剂或滴鼻液取按实施例l制得的精制处理的药物干粉10g使溶于250ml水中，即可分装成25瓶水剂，400mg/瓶。9.11.涂剂本品的干浸膏粉末可制成涂剂。9.12.膜剂取按实施例1制得的药物精制品30g、氮酮0.3ml加水100ml溶解后离心、经0.22um滤膜过滤于洁净容器内，加入PVA(05-88)19.5g适当加热搅拌使其溶解，洁净条件下在平板玻璃上涂成宽100mm、长约100mm、厚约O.lmm的药膜。再将宽约100mm、长100mm、厚约0.05mm的避光包衣薄膜在药膜上下两面各覆一层作为包衣膜，然后封装成膜剂。其剂量为0.3g/cm2，临用时按需要及其剂量剪切使用。9.13、液体口香糖在水剂中加入香料、矫味剂等制成液体口香糖，可作为口腔抗病毒消毒剂、抗病毒保健食品或功能性食品等。9.14.口香糖100g口香糖胶、O.lml薄荷油香料、戊糖lg作为矫味剂等制成口香糖可作为口腔抗病毒消毒剂、抗病毒保健食品或功能性食品等。10、组合物作为药物应用的安全性10.1、小鼠口服给药的急性毒性实验组合物为总糖肽与总黄酮与繁缕黄酮类按7:3组成(下同)，观察一次或数次给小鼠组合物饱和溶液后，试验动物所产生的急性毒性反应和死亡情况，为临床用量提供参考依据。10.1.2、试验材料动物健康普通级昆明种小鼠，体重1822g，雌雄各半，由安徽省医学科学研究所实验动物实验室提供。合格证皖医实动准字01号。药物组合物粉末(同上)；使用前用蒸馏水配成所需浓度。10丄3、试验方法组合物粉末的饱和溶液(400mg/ml):取小白鼠12只，禁食1416小时，体重19-21克，雌雄各半。视性别和体重将动物随机分为3组，每组4只，组间剂距比1:0.5。各组动物分别以0.4ml/10g体重灌胃给予组合物粉的溶液(400mg/ml、200mg/ml、100mg/ml)，观察口服受试药一周内，引起实验动物0%和100%死亡的致死剂量和动物所表现的症状。结果3组动物服药后，均未发现有动物发生中毒症状和死亡情况，故采用最大给药量试验。最大给药量试验(MTD):组合物粉取小鼠20只，雌雄各半，体重1820g。在24小时内，分别给各鼠连续灌胃给药两次(两次给药间隔为6小时)，每次灌胃给予组合物粉饱和溶液(400mg/ml)0.8ml/20g，累计灌服1.6ml，即时起观察小鼠中毒和死亡情况，连续观察7天。10丄4、试验结果(1).试验小鼠体重变化情况样品组动物给药后一周内，均无出现死亡，动物的活动、精神状态、饮食、排便等均未见异常。试验前与试验结束时小鼠体重变化分别见表3.:表3.组合物粉急性毒性试验小鼠体重变化(X±S)性别实验前体重(g)一周后体重(g)雌性18.7±0.8224.3士1.11雄性18.9±0.7425.8±1.01(2).组合物粉的最大给药量计算:小鼠最大耐受量组合物饱和液每毫升含组合物粉400毫克，小鼠平均体重为20g，每次灌胃容积0.8ml，共计2次。小鼠日服组合物粉最大耐受量=1.6mlx0.4g/ml/0.02kg=32g/kg安全限度以成人平均体重60kg为标准，组合物粉的日用量为lg;小鼠平均体重为20g，日最大用药量为1.6mlx0.4g/ml，安全限度二0.64g/20g+lg/60000g二1916.17(倍)10丄5、结论上述数据表明组合物口服给药的动物体内急性毒性试验未见有明显毒性等，因此组合物是一种很安全的天然药物。组合物小鼠口服给药，最大耐受量为32g/kg，较本发明人曾在CN1377680A及CN1498630A两份专利中公开的口服给药最大耐受量为11.25g/kg更好约3倍，相当于临床给药日剂量的1916.17倍。实验结果说明组合物在动物口服给药条件下未产生明显毒性反应，实验观察期间样品组实验动物体重自然增长，活动、精神状态、饮食以及排便等也未见明显改变，表明组合物毒性较低，按拟定临床剂量服用是安全的。11、组合物的一般药理实验及其结果11.1、对小鼠和大鼠精神神经系统的影响和对小鼠入睡个数的影响实验结论(1)组合物滴鼻剂0.67g/kg，0.33g/kg，0.16g/kg三个剂量组对小鼠戊巴比妥钠阈下睡眠剂量无协同作用，与戊巴比妥钠组比较无显著差异(P〉0.05)，提示组合物滴鼻剂对小鼠无催眠作用。(2)组合物滴鼻剂0.67g/kg，0.33g/kg，0.16g/kg各剂量组在给药后不同时间段对小鼠的自发活动计数，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，提示组合物滴鼻剂对小鼠的中枢神经系统无影响。(3)组合物滴鼻剂0.33g/kg，0.16g/kg，0.08g/kg各剂量组在给药后不同时间段大鼠转棒掉落次数，与对照组比较无显著差异(P>0.05)，提示组合物滴鼻剂对大鼠的行为没有影响。综上所述，组合物滴鼻剂对大鼠、小鼠的正常行为活动没有影响，与阈下睡眠剂量的戊巴比妥钠无协同作用，表明组合物滴鼻剂在受试剂量范围内对动物的精神神经系统无明显影响。11.2、组合物对麻醉犬心血管及呼吸系统的影响11.3、实验结论组合物0.67g/kg，0.33g/kg，0.16g/kg低、中、高剂量组对受试麻醉犬的血压无明显影响，与对照组比较无显著性统计学意义(P>0.05)。三个剂量组对受试麻醉犬的心率、心电图无明显影响，与对照组比较无显著性统计学意义(P>0.05)。组合物三个剂量组对受试麻醉犬的呼吸频率及幅度无明显影响，与对照组比较无显著性统计学意义(P>0.05)。12、组合物作为抗病毒药物应用的实施12.1、组合物具有更好的广谱抗呼吸道病毒效能12丄1、小鼠口服组合物体内抗流感病毒的实验研究12丄1.1、组合物组合物系纯中药提取物，为研究其抗流感病毒的作用，采用流感病毒感染小鼠病毒性肺炎模型，对口服组合物体内抗流感病毒作用进行了研究。本发明人己在CN1377680A及CN1498630A两份专利中公开了从繁缕属植物繁缕或其它一种繁缕属植物中提取的分子结构中含硫元素的总有机酚酸及其糖苷类或具苯甲酰、桂皮酰结构的酚类即总黄酮及其糖苷类等大极性化合物的组合物作为抗病毒药物的应用，包括细胞试验证明组合物能对分属RNA类的流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、埃柯病毒、疱疹病毒和属于DNA类的腺病毒等两大类呼吸道病毒有较强的抑制作用，特别是对流感病毒、副流感病毒及腺病毒3具有强大的抑制，因此具有独特的广谱抗病毒性能。其滴鼻剂在小鼠动物体内抗流感病毒FM,的试验结果显示50n/。小鼠保护率(ED5。)为0.51mg/kg，体内治疗指数高达4500以上证明组合物具有强大的抗流感病毒作用。组合物口服给药在小鼠动物体内抗流感病毒FM,的试验结果，由于口服给药后药物受消化道及肝脏首过效应的影响等，因此其治疗指数低于滴鼻剂给药的治疗指数是正常的，并在保持临床效果的同时使用更方便。12丄1.2、材料与药物12丄1.2.1、动物昆明种小鼠，体重1822g，雌雄各半，雌性未孕。12丄1.2.2、药物受试药组合物干粉(同上)。试验动物各给药组剂量为128mg/kg、64mg/kg、32mg/kg禾卩16mg/kg(按体表面积计算)，分别相当于人临床日用量的6倍、3倍、2倍和1倍。阳性对照药双黄连口服液，哈药集团三精药业有限公司产品，规格10ml/支，批号03051841，试验动物给药剂量为9ml/kg(按体表面积计算)，相当于人临床日使用量的9倍。利巴韦林，四川美达康药业有限公司产品，规格100mg/片，批号030212。试验动物给药剂量为106mg/kg(按体表面积计算)，相当于人临床曰使用量的9倍。以上药物均在使用前以蒸馏水配制成所需浓度。12丄1.2.3、病毒流感病毒甲1型鼠肺适宜株(FM,)，引自国家流感中心，由本所病毒研究室传代保存毒株。血凝效价E4:1280。12丄1.3、方法与结果12.1.1.3.1、FM,的增毒与保存取9日龄鸡胚尿囊腔接种FM!毒种液，34'C常规培养，48小时收集尿囊液。用微量血凝法收集血凝效价>1:1280的尿囊液，小管分装，置-70'C冰箱备用。12丄1.3.2流感病毒鼠肺适应株毒力的测定(LD50)取普通级昆明种小鼠30只，体重1822g，雌雄各半，雌性未孕。视体重和性别将小鼠分层随机分为5组，每组6只，其中雌雄各3只。在无水乙醚浅麻醉下，用FM,鼠肺适宜株流感病毒液50ul/只滴鼻感染小鼠，各组小鼠感染病毒的稀释度分别为l、10—1、10—2、10—3、10—4。小鼠感染病毒后，逐日观察和记录各组动物死亡数，连续观察14天。根据各组动物死亡总数，按Reed-Muench法计算小鼠感染病毒的半数致死量(LD50)。结果见表4.动物死亡百分率计算表表4.动物死亡百分率计算表病毒活鼠死鼠累积和死亡比例-死亡百分率稀籽度活鼠死鼠感染数/死亡数106011"1/11*100%3335/862.5%10-242722/922.22%10-3601300/130%io-4601900/190%*分母为感染小鼠总数(包括死、活鼠)A分子为死亡小鼠数从表8可见各稀释度感染小鼠的死亡率分别为100%、62.5%、22.22%、0%和0%。，能使半数感染小鼠死亡的稀释度应在10"10-2之间并计算035。值。第一步按公式距离比例=〉50%死亡百分率-50/>50%死亡百分率-<50%死亡百分率，将表中与LD5o值上(55%)和下(22%)相邻的数代入公式，求得距离比例数=62.5-50/62.5-22.22二0.31第二步将>50%动物死亡的病毒稀释度之对数，加上距离比例数，再乘以稀释系数的对数，即求得LD5。值。>50%动物死亡的病毒稀释度之对数为10"LD50=1+0.31X1(稀释系数10的对数)二1.31根据计算结果，求得小鼠滴鼻吸入感染FM,的LDs。为10—131。12丄1.3.3、组合物对流感病毒感染所致小鼠病毒性肺炎的治疗作用取普通级昆明种小鼠80只，体重1822g，雌雄各半。按表l所示剂量，视动物性别和体重将小鼠分层随机分为8组，每组10只，雌雄各半。在无水乙醚浅麻醉下，以5倍LD5。同批鸡胚传代毒种流感病毒液50ul滴鼻吸入感染7组小鼠，正常对照组滴入等量生理盐水溶液。各给药组动物于病毒感染的同时给予灌胃给药，每日2次，每次0.4ml/20g体重，连续给药6天，正常对照组及病毒对照组均灌胃给予等容积蒸馏水。自感染病毒之日起，逐日观察和记录各实验组死亡动物数，连续观察14天。以14天内每组动物死亡的总数按下列公式计算死亡率(生存率)、死亡保护率和平均存活时间。死亡率(生存率)=存活(死亡)数/实验动物数X100。/。；死亡保护率(％)=(对照组死亡率一实验组死亡率)X100%;平均生存日=同组内每只动物生存日数相加/实验动物数；延长生命率(％)=(实验组平均存活天数一对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数X100。/。。X2、t检验比较组间差异。结果见表5、表6:表5.组合物溶液对流感病毒感染小鼠死亡保护率的影响次数组另u剂量mg/kgXd死亡数/动物数死亡率%死亡保护率％正常对照组一0/12——病毒对照组一12/12100一双黄连口服液9mlX610/1283.3316.67利巴韦林片106X68/1266.67，,，，组合物液12.5X66/1250.0050.0025.0X64/1233.3366.6750.0X63/1225.0075.00100X62/1216.6783.33正常对照组—0/12一一病毒对照组一12/12100—双黄连口服液9mlX68/1266.6733.33利巴韦林片106X67/1258.3341.67组合物液16X632X664X6128X67/125/123/122/1258.3341.6741.6758.3325.0075.0016.6783.33复6i且合物溶液对流感病毒感染小鼠平均生存时间的影响次数组另u剂量mg/kgXd存活数/动物只数存活率%平均生存日x±s延长生命率％1正常对照组—12/12—>14.0±0—病毒对照组一0/12—5.08±1,16AA—双黄连口服液9mlX62/1216.678.5±3.03"67.32利巴韦林片106X64/1233.3310.17±3.10"100.20组合物液16X66/1250.009.08±3.15"78.7432X68/1266.679.88±3.25^100.2364X69/1275.0010.39士3.15^100.43128X610/1283.3310.8肚3.25**100.652正常对照组—一10/12—>14.0±0—病毒对照组—0/12—5.2士0.92"—双黄连口服液9mlX62/1216.678.6±3.34*65.38利巴韦林片106X65/1241.6710.2士2.94"96.15组合物液16X65/1241.678.91±2.77*96.1532X67/1258.339.56士3.35峙100.1564X69/1275.0010.39土3.15"100.43128X610/1283.3310.88±3.28**100.65与正常组相比"P〈0.01;与病毒组相比*P<0.05,<0.01表5与表6结果显示病毒对照组小鼠基本在病毒感染后5天左右全部死亡，而给予不同剂量的组合物溶液后，均可降低感染小鼠的死亡率，使感染动物平均生存日明显延长(以128mg/kg、64mg/kg剂量组极为显著)。其作用在一定范围内，可随着剂量的加大而增强。与病毒对照组相比，有显著统计学意义。组合物溶液64mg/kg、128mg/kg剂量组降低感染小鼠的死亡率和延长其平均生存时间作用与利巴韦林片相近，明显优于双黄连口服液组。12.1.1.3.4、组合物对流感病毒感染致小鼠病毒性肺炎模型肺病变影响取健康普通级昆明种小鼠80只，体重1822g，雌雄各半。按表ll所示剂量，视动物性别和体重将小鼠分存随机分为8组，每组10只，雌雄各半。在无水乙醚浅麻醉下，以5倍LD5Q同批鸡胚传代毒种流感病毒液50ul滴鼻吸入感染7组小鼠，正常对照组滴鼻吸入等量生理盐水。各给药组动物在病毒感染的同时分别给予灌胃给药，每天2次，给药容积每次0.4ml/20g体重，连续给药4天，正常对照组和病毒对照组均灌胃给予等容积生理盐水。感染动物隔离喂养，自由摄食，饮水。于末次给药后1小时，将动物称体重后固定，剪开胸部皮肤，切断左腋下动脉放血处死动物。解剖打开小鼠胸腔，取出全肺，剔除气管和肺门等淋巴组织后，用滤纸吸干肺脏表面液体，置天平称重，按肺重除以体重逐个计算肺指数和各组肺指数抑制率。用t检验比较组间差异性。留取肺组织标本，进行组织形态学观察和摄片。结果见表7.。表7.组合物溶液对流感病毒感染小鼠致病毒性肺炎肺指数影响<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>由表7结果可见与正常组相比，病毒对照组小鼠的肺指数明显增加，统计学意义极显著。给予不同剂量的组合物溶液后，感染动物肺湿重指数均明显低于病毒对照组(P<0.010.05)，其治疗效果可随着药物剂量的增加，肺指数值也相应的减少，呈现较好的相关关系。组合物溶液128mg/kg、64mg、32mg/kg剂量组动物治疗效果优于利巴韦林片，显著优于双黄连口服液组。12.1.2、口服给药使用于流感病人的临床实际效果取1.32g的组合物用1号胶囊填装成胶囊剂6粒，每次口服一粒，每天3次，可在1天半内治愈一例流感病人，最快的只需半天即可治愈。二年来临床自用治疗病毒流感有100多例次，无论是在流感病程的第几天，一旦使用了组合物即可在12两天左右控制临床症状进而达到治愈流感的目的，并可正常工作和学习了；包括服药后十多分钟至三十分钟内即可完全消除头痛，继而通鼻、消除清鼻涕、眼泪及浑身痛等症状，在24小时至36小时内退烧。越是发病早期使用效果越好，最快的病例曾在发病当晚(头疼、浑身痛、39.5°C、流眼泪、鼻涕等)临睡前用一次药，仅1粒，第二天早上即正常工作学习了。组合物预防及治疗病毒流感可达高效甚至特效药程度。12.2、口服和静脉注射给药的动物体内试验及其结果还表明组合物可明显降低动物体内乙肝病毒DNA，对肝炎病毒也有明显抑制效果12.2.1、药物组合物棕黄色药粉用生理盐水配制。阳性对照药物拉米夫定由葛兰素康威制药公司产品，批号B008923用生理盐水配制。12.2.2、肝炎病毒鸭乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，-70°〇保存。12.2.3、动物1日龄北京鸭，购自北京前进种鸭动物饲养场。12.2.4、试剂a"P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司，缺口翻译药盒购自普洛麦格公司(PromegaCo.);SephadexG-50,FicollPVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产；硝酸纤维素膜0.45jumAmersham产。12.2.5.1、实验方法鸭乙型肝炎病毒感染法1曰龄北京鸭经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分离血清，-7(TC保存待检。12.2.5.2、药物治疗试验DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行药物治疗试验，每组6只，给药组分2个剂量组，口服给药分别为250mg/kg和500mg/kg，腹腔注射给药组分别为25mg/kg和50mg/kg组，1天2次，给药10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用拉米夫定，口服给药50mg/kg，1天2次，给药10天。在感染后第7天即用药前(TO)，用药第5天(T5),用药第10天(T10)和停药后第3天(P3),自鸭腿胫静脉取血，分离血清，于-7(TC保存待检。12.2.5.3、检测方法取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态，按缺口翻译药盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。12.2.5.4、药效计算12.2.5.4.1、计算每组鸭不同时间血清DNAOD值的平均值(X士SD)，并将每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(TO)OD值比较，采用配对t检验，计tl、Pl值。分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。12.2.5.4.2、计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA抑制率，并作图，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态。给药前(TO)OD值一给药后(T5、TIO、P3)OD值DNA抑制。/f---X100%给药前(TO)OD值12.2.2.4.3、将给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。12.2.2.5、结果12.2.2.5.1、1日龄北京鸦感染DHBV后，血清DHBV-DNA动态DHBV-DNA感染鸭口服生理盐水后DHBV-DNA斑点杂交结果见表1。实验感染鸭36只血清DHBV-DNA全部阳性。病毒对照组6只雏鸭感染后第7天血清DHBV-DNA全部阳性，实验全程21天内血清DHBV-DNA水平感染后基本平稳。12.2.2.5.2、阳性药拉米夫定对DHBV-DNA的影响DHBV感染鸭口服阳性对照药拉米夫定50mg/kg，1天2次，给药10天。结果见表l、表2。配对分析，给药第10天(T10)与给药前(TO)的OD值比较，下降有非常显著性(P<0.01)，给药后对血清DHBV-DNA抑制率与病毒对照组，成组分析给药第10天(T10)有非常显著性差异(PO.Ol)。停药后3天(P3)无统计学意义，有反跳现象。12.2.2.5.3、组合物在DHBV感染鸭体内对鸭血清DHBV-DNA的影响的实验结果实验分口服给药和腹腔注射给药两种，分别选用两个剂量组，口服给药分别为100mg/kg，200mg/kg，1天两次，给药10天(BidX10);腹腔注射给药为15mg/kg，30mg/kg，l天2次，给药10天(BidX10)观察药物对鸭的毒性和鸭血清乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)d的影响。12.2.2.5.3.1、口服给药实验表明，组合物大剂量组口服给药200mg/kg，1天两次，无毒性，按配对统计，200mg/kg组给药后第5天、第10天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降(PO.Ol)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第5天，10天和停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA均有非常显著下降(PO.Ol,O.Ol)，其治疗指数为486,并且本品未见停药后的反跳现象。12.2.2.5.3.2、腹腔注射给药，大剂量组30mg/kg组，1天两次给药10天，按配对统计给药后第5天，治疗组鸭血清DHBV-DNA即有非常显著下降(PO.Ol)。成组统计与各自对照组比较有非常显著下降(PO.Ol,O.Ol)。15mg/kg组，按配对统计，停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著下降(PO.Ol)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第5天和停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著下降(PO.01),其治疗指数为1288，未见停药后的反跳现象。口服给药和腹腔注射给药均未见反跳现象是本品较阳性对照药拉米夫定等的更好、更重要的优点。12.3、组合物的有益效果还可由以下2个报告和临床应用结果给出12.3.1、报告l.细胞试验证明组合物能有效抑制艾滋病毒-l(HIV-1)结g:体外试验表明组合物具有抗艾滋病毒(HIV-1)的作用，结果如下药物浓度(mg/ml)0.200.100.050.025抑制率(％)98.58%64.3400%23.90%12.11%经统计计算IC5Q=0.113mg/ml阳性对照药AZT浓度在lg/ml时，抑制率为100%。12.3丄2、细胞毒性试验结果如下药物浓度(mg/ml)52.51.250.625细胞死亡率(％)7240.0414.88012.3丄3、经统计计算TC5(^3.235mg/ml，故安全指数(TC5。/IC5())为29.09。12.3.2、报告2.细胞试验证明组合物能有效抑制禽流感H5N1型病毒的结果12.3.2.1、药物"组合物"为繁缕提取物。12.3.2.2、病毒禽流感H5N1型12.3.2.3、细胞人胚肺细胞12.3.2.4、结果组合物对细胞无毒界限选择的结果见表8.:表8.组合物对细胞无毒界限选择(药物浓度mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>结果组合物以lmg/ml为无毒浓度12.3.2.5、细胞试验中组合物对禽流感H5N1型病毒的抑毒效果见表9.:表9.组合物对禽流感病毒的抑毒效果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>其方法为病毒以100TCID5。为感染量，先感染细胞单层，3小时后加药。12.3.2.6、结论"组合物"以lmg/ml浓度于体外细胞培养上有强烈抑制禽流感H5N1型病毒的作用。12.3.3、自用组合物口服给药临床治疗流感的实际疗效12.3.3.1、方法将组合物制成每片含组合物50mg的"含片"，每小时含化1片，每天给药10次，两天共给药lg。12.3.3.2、结果应用组合物的"含片"治疗11例流感病人的结果见表10.:表10.临床自用给组合物"含片"50mg/次治疗11例流感病人的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>黄XX男704.1.28头及浑身痛,流清鼻涕，39.5°C48小时痊愈顾XX女3304.2.16鼻塞流清涕39.8'C,血相不高次日上学季X男2704.11.07头痛流清涕39.5。C，血相不高次日上学朱xX男4804.12.22头及浑身痛，流清鼻涕，39.5°C36小时后上班何'x男1505.2.08头及浑身痛,流清鼻涕，39.5°C次日上学蔺XX女3605.2.26鼻塞流清涕39.8'C，血相不高次日上班<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>12.3.4.2、结论从表16.可见临床使用组合物治疗单纯疱疹和带状疱疹的病人，其用药量在0.2g0.5g之间、并可在1至3天内止痛、消疱、结痂从而达到痊愈，达到很满意的疗效。其中药物的浓度及疱疹面积大小与疗效有密切关系。12.3.5、组合物临床治疗小儿腮腺炎的实施结果12.3.5.1、方法取组合物制成每片含组合物50mg的"含片"，每小时含化l片，每天给药3次，两天共给药0.3g。12.3.5.2、临床自用治疗小儿腮腺炎的实施结果见表12.:表12.临床自用给含片50mg/片治疗10例腮腺炎儿童的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>12.3.5.3、结论组合物临床治疗小儿腮腺炎的实施结果可以看出腮腺炎病儿临床使用组合物的含片50mgX3片/天后、仅仅只需2天左右即可痊愈，可获特效药的疗效。12.3.6、组合物临床治疗病毒性性病尖锐湿疣的实际疗效12.3.6.1、方法组合物临床治疗病毒性性病尖锐湿疣时，采用口服和外用相结合的方法，即临床给予0.25g/cm2的膜剂并给予含量为O.lg的片剂口服进行治疗，取得更好的效果。12.3.6.2、疗效见表13.:表13.临床自用给予膜剂和片剂治疗7例尖锐湿疣病人的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>13.3.6.3、结论组合物临床应用治疗病毒性性病"尖锐湿疣"同样取得令人更为满意的效果。12.3.7、组合物作为"消毒剂"应用于预防流感、腮腺炎等的实例。12.3.7.1、方法使用组合物的"消毒剂"如气雾剂喷雾在口腔中喷雾、滴鼻在鼻腔中滴鼻、口服口香糖或液体口香糖等。12.3.7.2、结果组合物"消毒剂"预防流感和腮腺炎效果见表14.:表14.组合物"消毒剂"自用于预防流感、腮腺炎等的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>13.3.7.3、结论用组合物制成的气雾剂、滴鼻液、口香糖、液体口香糖等应用为预防呼吸道病毒的"消毒剂"取得令人更满意的效果。权利要求1、一种广谱抗病毒组合物，其特征是从植物繁缕或从其它一种繁缕属植物提取的一种分子量分布在1,000～100,000、呈深棕黄色粉末的总糖肽类与总黄酮类成份的组合物，并具有以下组成及理化性质(1)该组合物所含总肽中包括有环亮氨酸异亮氨酸二肽和环缬氨酸一酪氨酸二肽在内的环肽，总肽部份占该组合物的10％～25％，总肽经水解测得以下19种氨基酸，各个氨基酸占总肽的含量分别为天门冬氨酸12.118％～13.18％、谷氨酸13.036％～18.425％、丝氨酸4.156％～6.19％、组氨酸1.89％～1.946％、甘氨酸8.909％～9.915％、苏氨酸4.837％～7.129％、精氨酸2.92％～3.677％、丙氨酸6.05％～9.647％、酪氨酸2.596％～2.877％、胱氨酸0.2％～1.89％、缬氨酸5.94％～7.577％、蛋氨酸0.2％～2.09％、苯丙氨酸2.74％～3.738％、异亮氨酸4.28％～5.046％、亮氨酸4.70％～5.53％、赖氨酸5.77％～7.965％、脯氨酸4.61％～8.60％、γ-氨基丁酸1.25％～1.75％及α-氨基-γ-羟基-戊二酸1.04％～1.77％；(2)该组合物所含的糖包括葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖，经苯酚-浓硫酸法测得总糖在组合物中占15％～30％，与苯酚-浓硫酸反应呈现糖的棕黄色反应并在400nm～410nm和480nm～490nm出现两个最大吸收峰，其中400nm～410nm的峰为主峰要比480nm～490nm出现的吸收峰高一倍是其鉴别的重要特征；(3)该组合物中的总黄酮类占10％～40％，主要为芹菜素及其苷类，包括芹菜素、芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷，即新西兰牡荆苷-2、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-半乳糖苷、芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-C-β-D-半乳糖苷、芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖苷，即牡荆素、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖苷，即异牡荆素、麦黄酮-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷、麦黄酮-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、7-O-β-D-葡萄糖基-6-C-β-D-葡萄糖(6″-乙酰基)芹菜素。(4)组合物中除氨基酸、糖和黄酮以外的烷烃或/和包括醇类在内的含氧烷烃部份占25％～40％；(5)组合物中所含硫元素占1～4％，除胱氨酸、蛋氨酸等所含硫外，硫还形成硫酸酯多糖，或/和巯基或/和硫醚或/和硫醇或/和硫-硫结构；(6)组合物与三氯化铁试液显现酚类的一种深绿茶色反应，并在220nm～235nm处和330nm～350nm处出现两个最大吸收峰，其中220nm～235nm峰是主峰，要比330nm～350nm的峰高出一倍是其鉴别的另一个重要特征；(7)性状组合物呈棕色粉末状，略有苦味，易溶于水呈棕红色溶液。2、权利要求1所述的一种广谱抗病毒组合物，其特征是可从植物繁缕或从以下78种繁缕属植物中提取雀舌草、褐瓣雀舌草、安徽繁缕、钝萼繁缕、细尖繁缕、鹅肠草、沙生繁缕、阿里山繁缕、薄叶阿里山繁缕、北繁缕、短瓣繁缕、长瓣繁缕、东北繁缕、华繁缕、台湾繁缕、厚叶繁缕、皱叶繁缕、大卫繁缕、偃卧繁缕、针状偃卧繁缕、西南繁缕、石竹叶繁缕、二歧聚伞花繁缕、双歧繁缕、窄叶双歧繁缕、线叶双歧繁缕、铺散繁缕、翻白繁缕、泽繁缕、裸蕊异花繁缕、凹脉繁缕、杜氏繁缕、线茎繁缕、线柄繁缕、多花繁缕、禾叶繁缕、疏柔毛禾叶繁缕、变绿禾叶繁缕、江孜繁缕、霞草繁缕、湖北繁缕、兴安繁缕、内曲繁缕、薄叶繁缕、东繁缕、小花繁缕、柔繁缕、鹅肠繁缕、新沼生繁缕、八蕊繁缕、红莓繁缕、沼生繁缕、展叶繁缕、柄花繁缕、柄叶繁缕、长毛繁缕、假石生繁缕、小繁缕、燧瓣繁缕、网脉繁缕、岩繁缕、石生繁缕、抱茎石生繁缕、准葛尔繁缕、苏氏繁缕、星毛繁缕、园萼繁缕、拟伞花繁缕、小茸毛繁缕、三型繁缕、土耳其斯坦繁缕、湿地繁缕、伞花繁缕、绿花繁缕、巫山繁缕、五台繁缕、云南繁缕或牛繁缕属植物牛繁缕。3、权利要求1所述组合物的制备方法1，其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的生药或鲜草折算成干草，粉碎后用水提取得到水溶液经沉淀、离心或过滤后通过预先己处理好的大孔树脂柱以吸附所述组合物的成份，用水洗净大孔树脂柱，再将大孔树脂柱加温至45"C55。C后用同样温度的热蒸馏水洗柱并收集流出的深褐色蒸馏水液，继用加温至45t:55"C、浓度在5%35%的低级醇类或丙酮从树脂柱上洗脱，收集洗脱得到的棕红色或暗棕红色醇液或丙酮液，将此溶液回收醇或丙酮后与收集的深褐色水液合并，浓缩至比重达0.80至1.00后静置12小时，离心去除杂质，加浓度为95%的乙醇使溶液中醇或丙酮浓度达到50%70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤一次、2倍体积量的丙酮洗涤一次经5(TC6(TC真空干燥或加水溶解成比重为1.001.20的溶液再喷雾干燥即得组合物；低级醇类包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。4、权利要求1所述组合物的制备方法2，其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的鲜草或鲜干草洗净、粉碎后提取水溶液，将此水溶液经沉淀、离心或过滤后得到液体；将此液体经阴离子交换剂柱将所述组合物成份吸附在柱上，用2N氯化钠溶液将所述组合物成份从柱上洗脱下来，再经脱盐处理、雄縮至比重达0.80至1.00后静置12小时，离心去除杂质，加浓度为95%的乙醇使溶液中乙醇浓度达到50%70%，静置，滤取沉淀物并用3倍体积量的95%乙醇洗涤12次、'2倍体积量的丙酮洗涤12次，经50。C6(TC真空干燥或加水溶解成比重为1.101.20的溶液再喷雾干燥即得组合物；其中阴离子交换剂柱包括弱阴离子交换树脂柱和阴离子交换纤维素柱。5、权利要求1所述组合物的制备方法3，其步骤包括将植物繁缕或其它一种繁缕属植物的干药材粉碎后，用510倍体积的水浸提两次，每次13小时，合并提取得到的深棕色提取液，减压浓縮至比重0.70.9,静置12小时，滤除沉淀，溶液中加入95%低级醇类或丙酮使浓度达60%70%,静置12小时，滤集析出的沉淀物即得组合物粗品，将此组合物粗品用适量纯水溶解后经高速离心机15,000rpm，离心15分钟，离心后的澄清液先经孔径为0.22um的陶瓷膜处理设备精滤处理，再经切割分子量为2000以上的超滤膜超滤，将经超滤去除部分小分子量杂质后的溶液浓縮至比重0.70.9，加入低级醇或丙酮使浓度达85%进行二次醇沉，静置12小时后吸出上层清液，将沉淀物经减压抽滤近干，及时先后加适量无水乙醇和丙酮洗涤，抽滤至干，并立即经6(TC真空干燥即得较纯的粉末状组合物；其中低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇。6、权利要求1所述组合物可制成的药品剂型如下针剂、粉针剂、气雾剂、含片或咀嚼片、胶囊、滴丸、微丸、微囊、滴鼻剂或鼻喷剂、膜剂或涂剂、胶浆剂、水剂及口香糖等。7、权利要求1所述组合物在制备治疗艾滋病病毒药物中的应用。8、权利要求1所述组合物在制备治疗流感病毒，包括禽流感病毒的药物中的应用。9、权利要求1所述组合物在制备治疗疱疹病毒药物中的应用。10、权利要求1所述组合物在制备治疗肝炎病毒药物中的应用。11、权利要求1所述组合物在制备治疗腮腺炎病毒药物中的应用。12、权利要求1所述组合物在制备治疗尖锐湿疣病药物中的应用。13、权利要求1所述组合物在制备抗病毒的消毒剂中的应用。14、权利要求1所述组合物在制备抗病毒的保健品中的应用。全文摘要从繁缕属植物中用三种方法提取制备一种分子量分布在1,000～100,000的总糖肽类成份与总黄酮类成份的深棕色组合物作为更安全、更高效的广谱抗病毒天然药物应用。组合物中由包括天门冬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等17种氨基酸各按其比例构成的总肽部份占15％～25％；包括葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖的总糖占15％～30％，主要是芹菜素苷类的总黄酮占10％～40％；包括醇类在内的含氧烷烃部份占25％～40％。组合物可作为治疗艾滋病毒、肝炎病毒、包括高致病性禽流感病毒在内的流感病毒、尖锐湿疣病毒、疱疹病毒及腮腺炎病毒等病毒病的药物应用且未见毒性，可制成10多种药物剂型及保健品等，生产中对环境无污染。文档编号A61P31/14GK101390921SQ20071013208公开日2009年3月25日申请日期2007年9月21日优先权日2007年9月21日发明者毅曾,朱耕新,李泽琳,钱裕盛申请人:朱耕新