专利名称：用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、动物疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程DNA疫苗领域，更具体地，涉及一种用病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、疫苗及其制备方法。
背景技术：
目前，工业化生产的疫苗主要有三大类:一类是将病原体杀死或弱化以后作为抗原，直接制造疫苗；另一类是应用基因工程技术将抗原基因克隆到细菌中，通过细菌发酵生产抗原蛋白分子，然后制成蛋白质疫苗。第三类是将编码抗原蛋白的基因注射到体内，在体内源源不断地生产抗原蛋白，这就是DNA疫苗。但是，若从抗原的类型来衡量，DNA疫苗的本质是蛋白质疫苗。在这三类疫苗中，蛋白质疫苗最为安全，因为它不含病原体的遗传物质，不会因预防注射将病原体导入动物，致使病原体在动物体内形成新的传染源。然而，蛋白质疫苗存在两个重大弱点，在动物疫病预防上，目前尚不足于与常规疫苗竞争。第一，蛋白质提供的免疫信号较弱。在自然界，动物机体感知病原体入侵、做出相应的免疫反应并形成免疫记忆，是通过识别病原体表面的一些特殊分子标志来实现的。这种引起免疫反应的标记叫做抗原表位(epitopes)。抗原表位是病原体表面的一些分子簇，可以是一簇氨基酸，也可能是氨基酸上的多糖侧链，它们是膜蛋白的组成部分，有一定立体构型，存在的形式千差万别。但是，机体中原始淋巴细胞naive lymphocytes)种类也足够多，总会有一种淋巴细胞能识别新出现的表位，与之结合、做出免疫反应、并形成免疫记忆，在体内留存下专门对付这种病原的淋巴细胞。此后，当同一病原体再次入侵体内时，免疫系统依靠信息传递，能够刺激对此种病原体特异的淋巴细胞迅速增值，很快把病原体扑灭。预防注射的基本原理就是未雨绸缪，事先让机体接触某种病原体，以便形成免疫记忆，达到预防疫病发生的目的。因此，疫苗给机体提供强烈的免疫信号十分重要，可以说是预防注射成功与否的关键。然而，用基因工程技术生产的抗原蛋白分子，在溶液中呈自由折叠状态，虽然形成表位的那些氨基酸簇依然存在，但其立体构型与在病原体膜上已经不完全相同。所以，注射基因工程蛋白质疫苗形成的免疫记忆，与病原体入侵事件相比，并不完全相同，而且免疫信号比较弱。蛋白质疫苗与常规疫苗在 提供免疫信号上的差别，在图一中做了形象地描述，从图中可以更好理解蛋白质疫苗与弱毒疫苗的根本差别。由于这个缘故，基因工程生产的蛋白质疫苗，免疫效果一般都比不上用弱毒病原和灭活病原制作的疫苗。第二，蛋白质疫苗的生产成本高。常规疫苗的生产方式是细胞培养，其过程是用少量病原体作为种子，通过感染鸡胚或体外培养的细胞系使病原体自我增殖。当病原体增值到一定浓度时，收集和纯化病原体、甚至可以把培养液加以浓缩，直接加工成商品疫苗。由于在整个生产过程中充分利用了病原体自我增殖的特性，主要生产成本主要是培养介质的消耗，总的成本较低。而生产蛋白质疫苗需要通过基因工程细菌大规模发酵，然后从细菌中提取和纯化抗原蛋白质，再用纯抗原蛋白制作疫苗。由于多了一道抗原分离提纯工序，需要购置一定的设备、消耗许多昂贵的试齐U、而且需要水平更高的技术人员完成生产过程，生产成本自然会高于常规疫苗。
如何能才够克服上述两种疫苗的缺点，同时又能保留它们各自的优点？疫苗研究和技术改进的主要目标有三个方面:第一，通过基因缺失和突变技术研制无致病性的突变体病原。这种病原体保留了弱毒疫苗和灭活疫苗病原体的繁殖力，又不会致病，当然很理想。但是，病原体的致病因子往往就是引起免疫反应的因子，在克服致病性的同时保留免疫原性不是一件容易办得到的事情，数十年来，研究进展很小。第二，克服蛋白质免疫性不强的弱点。目前主要是通过蛋白质融合的方式，增加抗原蛋白的异质性。但是，只要是采用离体的自由蛋白质分子作为抗原，免疫识别表位的存在形式永远不等同于病原体上表位，所以，这种技术路线对蛋白质疫苗的改进效果有限。第三，生产空壳病毒制作疫苗。这种路线的出发点，是去除病原体繁殖的遗传物质，但保留能正常诱导免疫反应的蛋白质外壳。理论上将，这是一种先进的技术思路，制作的疫苗应当安全而有效。但是，实施这种技术需要使用动物生物反应器之类高效生产手段，不然很可能因为产品价格太高而无法推广。基于上述技术背景，本发明从免疫信息提供的机制入手，研究出一种替代技术，技术原理类似于空壳病毒，但使用的“壳”不是原来的病原体，而是一种无害病毒。这种疫苗的种安全性类似蛋白质疫苗，效能应接近常规疫苗。本发明是在疫苗生产原理方面是一种新的技术尝试，在科学上有其正当理由，在实用上有巨大经济意义。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、疫苗及其制备方法，其能最大限度地模拟各种抗原在天然病原体外膜上的存在状况，进而增强抗原呈递免疫信号，普遍提高蛋白质疫苗的免疫效果。本发明的技术方案为:一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体，其特征在于:所述载体由基因克隆载体pUC18以及克隆到pUC18载体上的一个DNA片段组成，所述DNA片段的基因序列如SEQ ID NO:1。

一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位而制备动物疫苗的方法，其特征在于:包括以下步骤:(I)使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1-149位氨基酸的编码DNA序列为骨架；(2)去掉所述骨架中组成钩状突起的79-82位氨基酸编码；(3)在所述79-82位氨基酸编码的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的编码DNA序列； (4)在所述柔性肽编码DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的编码DNA序列，形成三个核酸内切酶识别位点，从而形成一个DNA片段；(5)将所述DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体；(6)在所述核酸内切酶识别位点插入需展示的抗原基因，完成基因重组；(7)把基因重组后的载体转移到大肠杆菌或动物细胞表达载体上进行基因表达，产生融合蛋白；(8)生产融合蛋白产品。可选地，所述步骤7采用大肠杆菌表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤:(I)分离包涵体；(2)洗涤包涵体；(3)溶解包涵体；(4)产品纯化；(5)蛋白质重新折叠。可选地，所述步骤 7采用动物细胞表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤:(I)融合蛋白分泌到细胞培养液中；(2)把细胞培养液加在层析柱上，使其流过亲和层析介质，产品得以纯化。一种动物疫苗，其特征在于:所述动物疫苗采用如权利要求2至4任一项所述的方法制备而成。本发明的优点:由于本发明利用单一的病毒核心颗粒可展示多种不同的抗原表位，并且能最大限度地模拟各种抗原在天然病原体外膜上的存在状况，用病毒核心颗粒展示抗原表位的载体也很易于构建，这使得疫苗制备简单、生产成本大大降低，与现有疫苗相t匕，免疫信号更加强烈，免疫效果十分突出。


参照附图，在随后的详细描述中，本发明的优点和特征会更加显而易见，所述附图解释本发明的优选的、非限制的实施例，其中:图1是免疫系统对病原体上固定表位和抗原蛋白上游离表位的识别的示意图，其中，菌体(左)能给免疫细胞提供强烈免疫信号；而游离表位(右)提供的免疫信号比较弱；图2是乙肝病毒核心颗粒的结构的示意图；图3是乙肝病毒核心颗粒展示蛋抗原表位的原理的示意图；图4是抗原表位展示能提高免疫信号的呈递的示意图；图5是pZNVC的工作模式示意图；图6是原核生物表达载体的示意图；图7是真核生物表达载体的示意图；图8是大肠杆菌生产重组蛋白质的工艺流程的流程图；图9是用乙肝病毒核心颗粒展示绿色荧光蛋白的示意图；图10是乙肝病毒核心颗粒展示肌肉抑制素真肽的示意图；图11是肌肉抑制素基因缺失导致小鼠肌肉超常发育的对比图，其中下部图为正常小鼠的后肢和臀部肌肉，上部图为基因缺失小鼠超常发育的后肢和臀部肌肉；图12是大肠杆菌表达载体PQE-80L图谱图；图13是真核细胞表达载体pcDNA 3.1myc-HisA图谱图。
具体实施例方式疫苗的保护力在于其诱导机体产生的免疫反应强，而机体免疫反应的强弱依赖抗原提供的免疫信号的强弱。为改进抗原蛋白对免疫信号Gpitopes)的呈递，有几种可行的技术值得探索。第一种技术是通过基因组操作制造无害的突变体，这种思路已被许多人推崇并进行着切实的探索。但是，这种技术路线也有两个潜在的弱点:首先，是工作难度比较大，找出病原体可以基因缺失或突变的部位，使病原体毒性减低甚至消失而不降低病原体的增值能力，是一件很困难而长期的工作；其次，即使成功地研制出无害的突变毒株，也不是一劳永逸的事，因为基因突变毒株长期使用后，很可能在被免疫的动物体内回复突变成强毒。第二种受人推崇的技术是生产空壳疫苗，就是同时表达病原体的外膜蛋白，体外组装没有遗传物质的病毒空壳制作疫苗。这肯定是一项完美的技术，但只适用于基因组较小的病毒，对于有上百个基因的大型病毒和几千个基因的病菌，很难同时表达它们全部必要基因。同时，能一次表达好几个基因的体系，只有动物生物反应器能胜任，用其它表达技术生产空壳病毒在成本上不可行。剩下的一种可能就是模拟病原体呈递表位的技术，也就是选用某种适宜的病毒作为装载工具，在其表面表达其它病原的表位。本发明采用人乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒的作为装载工具，将各种抗原蛋白质，或者含有抗原表位(epitopes)的合成肽链，展示在 病毒空壳颗粒的表面，模拟天然病原体在体内呈现抗原信号的方式，以期改进蛋白质疫苗的免疫原性。这种呈递抗原表位的方式，就其性质来讲，类似于天然病原体，而与自由状态的抗原蛋白质分子呈递表位的方式有很大差别(图3)。此种技术发明的理论基础，来源于对乙肝病毒的基础研究。在乙肝病的医学研究中发现，部分感染乙肝病毒的患者，即便疾病已经痊愈，其体内长期存在病毒核心颗粒，虽无明显临床症状但刺激强烈的免疫反应(5)。同时，乙肝病毒结构研究证明，乙肝病毒核心颗粒是由一种单一的核心蛋白堆砌而成。该蛋白由183个氨基酸组成，其中N端的144个氨基酸折叠成两个柱状体，形成组装核心颗粒的“砌块”，尾部的一段氨基酸折叠到颗粒内部，而第79-82位氨基酸是连接两个柱状体的纽带，形成暴露在病毒颗粒的表面的突起(图4)。这个突起也是乙肝病毒核心颗粒主要表位所在之处出)。根据上述原理，我们采用人工合成的方法，得到了包含编码乙肝病毒核心颗粒蛋白质1-149位氨基酸的一个重组基因。合成过程中消去了第79-82位氨基酸的遗传密码，代之以一段编码柔性肽和核酸内切酶识别位点的DNA片段。这个合成基因可以作为展示异种抗原蛋白的工具(图5)，用它作为一个技术平台构建表达载体(图6、图7)，并在适当基因表达系统使基因获得表达之后，就形成这样一种功能蛋白质:其1-78位氨基酸组成左臂和第83-149位氨基酸组成右臂，将形成组装病毒颗粒的“砌块”，在生理条件下能自动组装成病毒颗粒，连接两臂的柔性肽将在病毒颗粒表面形成带状突起。柔性肽由不带侧链的小氨基酸组成，用来保持乙肝病毒核心抗原蛋白和被展示的蛋白两种分子的自由度，防止它们相互影响彼此的分子构型。因此，若把被展示的抗原蛋白插入其中间部位，该蛋白将会独立折叠成其天然构型并被展示在乙肝病毒核心颗粒的表面。为了更清楚的说明本发明能够模拟天然病原体改进蛋白质疫苗对免疫信号的提呈，在下一节中将用图解的方式展示其工作原理。同时，为证明这种技术的可靠性，作为应用的实例，特地将水母绿色荧光蛋白和猪的肌肉抑制素活性肽展示在乙肝病毒核心颗粒表面(图9、图10)。图1是免疫系统对病原体上固定表位和抗原蛋白上游离表位的识别的示意图。图中左半边所示，是病原体入侵机体之后免疫系统做出的反应。在这个反应中，穿行于血液和淋巴循环系统之间的先天性淋巴细胞(naive lymphocytes)能识别病原体表面的表位(epitopes),当多个淋巴细胞受体分子与病原体表位相结合时,集体向淋巴细胞和整个免疫系统提供强烈的免疫信号。图中右半边所示，是注射游离的抗原蛋白质后免疫系统做出的反应。在这个反应中，由于蛋白质分子脱离了细胞膜，表位(epitopes)分散地存在于游离的蛋白分子上，立体构型也发生变化，虽然淋巴细胞也能识别这种分散的表位，但传递给淋巴细胞的免疫信号较弱。因此，纯化的抗原分子提供的免疫信号弱，免疫效果差。图2是乙肝病毒核心颗粒的结构的示意图。乙肝病毒的核心颗粒由90-150个拷贝的核心蛋白分子堆砌而成，每个蛋白分子的两个功能域折叠成双柱体，形成建造病毒颗粒的“砌块”。双柱体的两个柱形结构由五个氨基酸组成的短肽连接，连接肽在病毒表面形成钩状突起；而富含正电荷的肽段与核酸有亲和性，因而被包在颗粒内部与遗传物质相结合。下图中的线性图表示乙肝病毒核颗粒心蛋白编码基因结构，蜡笔状线条代表病毒核心颗粒蛋白的两个功能域，中间的黑色粗线条代表想要展示的目标蛋白基因，细的连线代表病毒表面突起的氨基酸编码。下左边的柱状图显示病毒颗粒蛋白分子能折叠成许多个柱状体分子，黑色连线表示目标蛋白处在柱状体顶端。下右图显示病毒颗粒的外壳由许多蛋白分子堆砌而成，注意颗粒内部的空腔和突出在病毒颗粒表面由黑色短线形成的突起，那是展示目标蛋白的关键部位。图3是乙肝病毒核心颗粒展示蛋抗原表位的原理的示意图。根据乙肝病毒核心颗粒的特性，通过基因重组技术可以把其它抗原的表位展示在病毒颗粒的表面，成为一种新型疫苗制造技术。在下图中，上边的线性图代表重组后的乙肝病毒核心颗粒蛋白的基因结构，其中带有竖粗线条代表新插入的抗原基因，图中其它部分的意义与图二中的线形图相同，即:灰色蜡笔式粗线代表组装病毒颗 粒的两个功能域，黑色细线代表组成病毒突起的几个氨基酸和连接肽的编码DNA序列。下边的图形代表融合蛋白质组装成病毒颗粒的情况，注意新插入的抗原蛋白被插入到病毒的突起上，原来的钩状突起已被延长，抗原蛋白质分子被展示在病毒突起上，表位(epitopes)不再呈游离状态，而是被固定和分布在病毒颗粒的整个表面。这种技术模拟病原体向被侵害细胞呈递抗原表位的方式，能增强疫苗对免疫f目号的呈递。图4是抗原表位展示能提高免疫信号的呈递的示意图。决定一种疫苗免疫效能(免疫原性)高低的主要因素，是免疫系统对这种疫苗的识别和做出相应的免疫反应。当一种强毒侵害机体时，先天淋巴细胞(naive lymphocytes)与之相遇，淋巴细胞上的许多受体与病原体上的许多表位同时结合，产生强烈的免疫信号。通过信号传递，形成免疫记忆。当同一种病原体再次入侵时，将会刺激已经存在的淋巴细胞迅速发增殖，产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应，迅速杀灭病原。注射疫苗属于未雨绸缪，以注射无害抗原诱导机体产生免疫反应，形成免疫记忆。当真正的病原体来临时，机体已有准备，不会出现严重病症。疫苗的最重要品质是它们的保护力，保护力的产生源于疫苗引起免疫反应的强度，而免疫反应的强度在于淋巴细胞对表位的识别。图中左边的图示表示:当天然病原体(长圆形杆菌)入侵机体后，淋巴细胞借助许多特异受体与病原体的表位结合，提供强烈的免疫信号。图中右边的图表示:抗原表位经乙肝病毒颗粒展示后，每一个病毒颗粒的表面存在90-150个拷贝的抗原分子，淋巴细胞的许多受体将与同病毒颗粒上的表位结合，类似与天然病原体，能提供强烈免疫信号。图5是pZNVC的工作模式示意图。根据上述免疫信号产生和传递的原理，我们应用基因重组技术，构建了一种专门用来展示各种抗原的基因克隆载体，以便于生产重组乙肝病毒核心蛋白颗粒。这种载体被命名为pZNVC，是用乙肝病毒核心颗粒展示各种表位的基本框架。下面展示的是pZNVC功能元件的DNA序列，即pZNVC主体部分的DNA序列:
权利要求
1.一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体，其特征在于:所述载体由基因克隆载体pUC18以及克隆到pUC18载体上的一个DNA片段组成，所述DNA片段的基因序列如SEQID NO:1。
2.—种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位而制备动物疫苗的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1-149位氨基酸的编码DNA序列为骨架； (2)去掉所述骨架中组成钩状突起的79-82位氨基酸编码； (3)在所述79-82位氨基酸编码的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的编码DNA序列； (4)在所述柔性肽编码DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的编码DNA序列，形成三个核酸内切酶识别位点，从而形成一个DNA片段； (5)将所述DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体； (6)在所述核酸内切酶识别位点插入需展示的抗原基因，完成基因重组； (7)把基因重组后的载体转移到大肠杆菌或动物细胞表达载体上进行基因表达，产生融合蛋白； (8)生产融合蛋白产品。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤7采用大肠杆菌表达载体进行基因表达，所述步骤8进而 包括以下步骤: (1)分离包涵体； (2)洗涤包涵体； (3)溶解包涵体； (4)产品纯化； (5)蛋白质重新折叠。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤7采用动物细胞表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤: (1)融合蛋白分泌到细胞培养液中； (2)把细胞培养液加在层析柱上，使其流过亲和层析介质，产品得以纯化。
5.一种动物疫苗，其特征在于:所述动物疫苗采用如权利要求2至4任一项所述的方法制备而成。
全文摘要
本发明涉及一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、动物疫苗及其制备方法，其采用人工合成DNA的方法，合成乙肝病毒核心蛋白必要的氨基酸的编码DNA序列。在合成过程中，使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1-149位氨基酸的编码DNA序列为骨架，去掉了骨架中第79-82位氨基酸的编码序列，只保留与组装病毒颗粒有关的编码DNA；为便利乙肝病毒核心颗粒蛋白中插入其它抗原蛋白，特别在第79-82位氨基酸的部位插入一段编码柔性肽的DNA序列，并在该序列中引入三个内切酶位点，便于基因操作；将上述合成DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用来展示抗原表位的专门载体pZNVC。在pZNVC插入一个抗原蛋白基因或编码表位的合成DNA片段，并在原核或真核生物中表达出融合蛋白，乙肝病毒N端的78个氨基酸和C端的68个氨基酸将折叠成两个柱状体，形成组装核心蛋白颗粒的“砌块”；柔性肽将形成连接两个柱状体的纽带，而插在柔性肽中间的蛋白质将突起在病毒颗粒的表面。柔性肽是由不带侧链的一串小氨基酸组成，具有柔韧性，不干扰乙肝病毒核心颗粒蛋白和抗原蛋白各自独自折叠成其天然分子构型。使用pZNVC来展示抗原蛋白抗原表位，可以最大限度地模拟它们在天然病原体外膜上的存在状况。
文档编号A61P31/20GK103184231SQ20111045494
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者陈永福, 张国华, 郑立, 于娟娟, 张岩松 申请人:北京中农创新生物工程研究院有限公司