专利名称：雷帕霉素(rapamycin)衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及雷帕霉素衍生物、包含这类衍生物的药物组合物、以及治疗致病性真菌的方法、诱导免疫抑制(immunosuppression)的方法和利用这样的雷帕霉素衍生物治疗致癌性肿瘤的方法。
雷帕霉素是一种天然存在的大环三烯抗生素，它可以通过在一种含水的营养介质中培养有机体来产生。它的结构可以表示如下
至少有一种产生雷帕霉素的Streptomyces hygroscopius菌种被保存在Northern Utilization and Research Division，Agricultural Research Service，U.S.Department of Agriculture，Peorias，Illinois，U.S.A.，寄存号为NRRL 5491。雷帕霉素，以及通过培养NRRL 5491来制备它的方法都公开在美国专利3929992号中，
公开日为1975年12月30日，全部公开内容在这里被编入作为参考。
本发明涉及新型雷帕霉素衍生物，其通式如下
其中R1选自由＝O，(-OR6，H)和(H，H)组成的组;
R2选自由＝O或(H，H)组成的组，前提条件是当R1为(-OR6，H)或＝O时，R2为(H，H);
R3和R6独立地选自由-H、-C(＝O)R7、-C(＝O)OR7、-C(＝O)NHR7和-C(＝S)OR7组成的组;
R5选自由-H和C1-C4烷基组成的组;和R7选自由C1-C10烷基、C3-C6环烷基、芳基、和杂环基组成的组;
前提条件是，当R1为＝O时，则至少满足下列情况之一(a)R2不是＝O，(b)R3不是H，和(c)R5不是H。
还涉及其药物上可接受的盐、水合物或者溶剂化物。
本发明还涉及一种药物组合物，它包含有效量的一种或多种通式Ⅱ的化合物和一种药物上可接受的载体或稀释剂。
本发明还涉及一种在需要抑制致病性真菌的人或其他动物体内抑制致病性真菌生长的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的一种或多种通式Ⅱ的化合物。
本发明还涉及一种在需要诱导免疫抑制的人或其他动物体内诱导免疫抑制的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的一种或多种通式Ⅱ的化合物。
另外，本发明涉及一种治疗人或其他动物体内的致癌性肿瘤的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的一种或多种通式Ⅱ的化合物。
此外，本发明进一步涉及通式Ⅲ的化合物，它们可用作制备通式Ⅱ的化合物的中间体
其中R′为-(S)COPh，其中Ph为苯基;
R″选自由H和-(S)COPh组成的组，以及其中R2和R5是上面已定义的基团。
此外，本发明进一步涉及一种从通式Ⅲ的中间体来制备通式Ⅱ的新型化合物的方法。
当任何取代基或变量(例如，芳基、烷氧基、R1、R2、R3、R5、R6、等)在通式Ⅱ的任何化合物的结构式中出现不止一次时，每种情况下该变量或取代基的定义都与每种其他情况下的定义无关，除非被特别说明的外。取代基和/或变量的结合是本发明化合物的一个组分，只有当这种结合会导致产生一种稳定的化合物时，这种结合才被允许。
在取代基例如R1的定义中所采用的括号中的术语[例如，(H，OR6)]是用来反映相关原子的两化合价上的取代基。本发明并不限于特定的同分异构体，并且括号中部分的次序也并不认为是一种特定的构型。
如这里所采用的，除非其中另有别的说明外，术语“烷基”意指支链的、直链的、饱和的和不饱和的脂族烃基。优选的烷基有1-6个碳原子，除非有另外说明的外。这样的烷基可以任选地被一种或多种独立选自下列组中的基团所取代，这组基团是由芳基、羟基、C1-C6烷氧基、酸基、氨基、N-酰氨基、酮基、卤素、氰基和羧基组成的。术语“烷基”还包括上述基团，其中选自氧、氮和硫的杂原子取代烷基部分中的一个或多个碳原子。
如这里所采用的，术语“芳基”意指包括环状的、杂环的、多环的和杂多环的不饱和C4-C14部分，特别是苯基或萘基。这样的芳基可以任选地被1-5个的独立地选自以下由C1-C6烷基、芳基、羟基、被护羟基、C1-C6烷氧基、酸基、氨基，N-酰氨基、-S(O)n烷基、硝基、氰基、羧基和卤素组成的组的基所取代。
如这里所采用的，术语“烷氧基”代表在此定义的指定数目碳原子的与氧桥相连的烷基。
如这里所采用的，术语“酸基”被用来代表基团-OC(O)-(烷基)和-OC(O)-(芳基)。
如这里所采用的，术语“氨基”被用来代表基团-NH2、-N(烷基)2、-NH(烷基)、-N(芳基)2、和-NH(芳基)。
如这里所采用的，术语“N-酰氨基”被用来代表基团-NHC(O)-(烷基)和-NHC(O)-(芳基)。
如这里所采用的，术语“酮基”被用来表示-C(O)-部分。
如这里所采用的，术语“卤素”被用来包括氟，氯，溴和碘。
如这里所采用的，术语“环烷基”被用来包括有特定数目碳原子的饱和的和不饱和的烃的脂环基团。这样的环烷基可以任选地被一个或多个独立选自由芳基、羟基、C1-C6烷氧基、酸基、氨基，N-酰氨基、酮基，和卤素组成的组的基团所取代。
如这里所采用的，术语“杂环”被用来包括稳定的5元～7元的单环或双环杂环、或稳定的7元-10元的双环杂环，它或者是饱和的、或者是不饱和的，并且由碳原子和独立地选自由N、O和S组成的组中的1-3个杂原子组成，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，而且氮杂原子可以任选地被季铵化，它还包括任何的双环基团，其中任何的上述定义的杂环是与苯环相稠合的。该杂环可以被连接到任何导致形成稳定结构的杂原子或碳原子上。这种杂环组分的实例包括，但并不局限于，哌啶基、哌啶子基(piperidinyl)、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、呋喃基、和噻吩基。杂环可以使与一杂原子相连的碳原子不是直接被杂原子所取代的方式而被一～四个的独立地选自由C1-C6烷基、芳基、羟基、C1-C6烷氧基、酸基、氨基、N-酰氨基、硝基和卤素组成组中的取代基所随意地取代。
本发明的优选化合物包括下列化合物，其中，一起或独立的是1.R1选自由(H，H)、(H，OH)和＝0组成的组;
2.R2为＝O;
3.R3为H;和4.R5为H。
特别优选的化合物是下列化合物，其中1.R1为(H，H)，R2为＝O，R3为-H和R5为-H。
2.R1为(H，OH)，R2为(H，H)，R3为-H和R5为-H。
3.R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为-H和R5为-H。
4.R1为＝O，R2为(H，H)，R3为-H和R5为H。
5.R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为-C(O)R6和R5为-H。
6.R1为(H，H)，R2为＝O，R3为-C(＝O)R6，和R5为H。
7.R1为(H，OC(O)OR7)，R2为(H，H)，R3为-H，和R5为-H。
8.R1为(H，OH)，R2为(H，H)，R3为-H，和R5为C1-C4烷基。
本发明的化合物可以以游离的形式存在，或者在适当的场合以盐的形式存在。药物上可接受的盐及其制备方法是本领域技术人员已经所熟知的。本发明化合物的药物上可接受的盐包括那些例如由无机或有机酸或碱形成的这样化合物的惯用的无毒性的盐或季铵盐。
本发明的化合物可以形成水合物或溶剂化物。本领域的技术人员都知道，带电的化合物当与水一起冷冻干燥时会形成水合物，或者当与适当的有机溶剂在溶液中被浓缩时会形成溶剂化物。
本发明的化合物可以通过下面所公开的方法或其惯用的改进方法由雷帕霉素来制备，而采用的试剂或者是文献中所描述的，或者是市场上可买到的。
本发明的某些化合物可以用通式Ⅲ的新型苯硫羰碳酸盐中间体来制备。这些中间体的制备，以及它们向本发明化合物的转化都表示在图A中。如图A所示，雷帕霉素(尽管也可以采用雷帕霉素的衍生物)在一种碱例如二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下与苯氯硫羰甲酸盐接触来制备在C-28和/或C-43原子上衍生的雷帕霉素。这些中间体(通式Ⅲ)可以通过和一种基于游离基的还原剂例如氢化三烷基锡或三(三甲基甲硅基)硅烷和一种自由基引发剂例如偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰或三乙基硼烷反应来转化成本发明的化合物。
本发明的在C-43位带一个含氧(＝O)部分的化合物可以按图B所示的方法制备。图B表明了43-脱氢雷帕霉素的制备，它是作为制备本发明其他化合物的中间体。
本发明的在C-28位衍生的化合物可以在碱例如二甲氨基吡啶的存在下通过使R5为H的化合物与适宜的酰基氯(例如，R7C(O)Cl、R7OC(O)Cl、R7NHC(O)Cl或R7OC(S)Cl相接触来制备。
在下面的说明书中所提供的实施例给出了制备本发明化合物的各种合成方法。
本发明还涉及药物组合物，包含一种药物上可接受的载体或稀释剂和有效剂量的一种或多种通式Ⅱ的化合物。
通式Ⅱ的化合物是以常规剂量的形式来供给的，它是按照常规步骤将治疗上有效量的化合物(“活性成分”)与标准的药物载体或稀释剂相混合来制备的。这些步骤根据适于所需的制备的情况可包括将各种成分的混合、造粒和压制或溶解。
药物载体可以采用，例如，或者是固体或者是液体。典型的固体载体是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。典型的液体载体是糖浆、花生油、椰榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域众所周知的延时材料，例如单独采用单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯，或者将其与蜡、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等一起使用。
可以广泛采用各种各样的药物形式。因此，如果用固体载体，则制剂可以被制成片、以粉末或丸的形式放入硬明胶囊、或制成锭剂或糖锭。固体载体的量可以在很宽范围内变化，但优选的是在约25毫克～约1克范围内。如果用液体载体，则制剂可采取糖浆、乳液、软明胶囊、无菌注射液或在针药管或管形瓶中的悬浮剂或无水液态悬浮剂。
为了获得一种稳定的水溶性的剂量形式，把本发明化合物的药物上可接受的盐溶解在有机或无机酸的水溶液中，例如0.3M的琥珀酸溶液，或者优选为柠檬酸溶液。另一种方法是，可以把酸性衍生物溶解在适当的碱溶液中。如果得不到可溶性盐的形式，则把本发明的化合物溶解在适当的共溶剂或其混合物中。这类适宜的共溶剂的实例包括，但不局限于乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、多乙氧基醚80，丙三醇等，浓度在总体积的0-60%范围内。
试验表明，本发明的化合物可用于需要抑制致病真菌生长的人体或其他动物体内在预防或治疗方面抑制致病真菌的生长。因此，本发明包括在需要抑制致病真菌生长的人体或其他动物体内抑制致病真菌生长的方法，它包括向这样的人或动物供给有效的、无毒剂量的通式Ⅱ的化合物。
术语“致病真菌”是指能够在人体或其他动物体内产生疾病的真菌。致病真菌的实例包括，但不局限于白色念珠菌和其他念珠菌种、石膏样小孢子菌、须疮毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、曲霉菌种和孢子丝菌种。本发明的化合物抑制致病真菌生长的能力可以通过已知的并用于此目的的标准试验来证明或预测，例如，在下面所描述的酵母测定。
本领域的技术熟练人员可以通过常规实验来测定将用多大剂量的有效的、无毒性化合物来实现抑制致病真菌生长的目的。但一般来说，有效剂量应在每千克体重每天约0.05-100毫克范围内。
试验表明，本发明的化合物也可用于诱发免疫抑制，即诱发一种人或动物免疫系统的抑制。因此，本发明还涉及在需要诱发免疫抑制的人体或动物体内在预防或治疗方面诱发免疫抑制的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的本发明化合物。
本发明化合物诱发免疫抑制的能力可以从用于此目的的标准试验中得到证明，例如，混合淋巴细胞反应试验或通过测定摄取胸苷(thimidine)的量来测定抑制T细胞增殖的试验。
本发明的化合物可用于诱发免疫抑制的事实意味着它们可用于治疗或预防对移植的器官或组织(例如肾、心脏、肺、骨髓、皮肤、角膜等)的抵抗或排斥;治疗或预防自身免疫的、发炎的、增殖的和高增殖的疾病，和治疗或预防免疫学上中间疾病在皮肤上的表现(例如类风湿性关节炎、红斑狼疮、系统性红斑狼疮、淋巴瘤性甲状腺肿、多发性硬化、重症肌无力、1型糖尿病、眼色素层炎、肾病综合症、牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎和其他湿疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、扁平性红苔藓、天疱疮、大疱性天疱疮(bullous Pemphigoid)、大疱性表皮松解(Epidermolysis bullosa)、热激性皮炎、血管水肿、脉管炎、红皮病、皮肤嗜曙红细胞增多、簇状脱发等);治疗可逆性气道阻塞疾病、肠炎和过敏反应(例如腹腔疾病、直肠炎、嗜曙红细胞增多胃肠炎、乳大细胞(贮积)病、Chrohn病和溃疡性结肠炎)以及与食物有关的过敏反应(例如偏头痛、鼻炎和湿疹)。
本发明技术熟练人员能够通过常规实验测定出多大剂量的有效的、无毒性化合物能实现诱发免疫抑制的目的。但一般来说，有效剂量应在每千克体重每天约0.05-100毫克范围内。
本发明的化合物还应当适用于治疗哺乳动物体内的致癌肿瘤。更确切地说，该化合物应当适用于减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长和/或延长带肿瘤动物的存活时间。因此，本发明还涉及一种治疗人或其他动物体内致癌肿瘤的方法，它包括向这样的人或动物供给有效的、无毒剂量的通式Ⅱ的化合物。本领域技术熟练人员能够通过常规实验测定出多大剂量的有效的、无毒性化合物能实现治疗致癌肿瘤的目的。但一般来说，有效剂量预计在每千克体重每天约0.05-100毫克范围内。
本发明的化合物可以按照前述治疗方法，以足以产生治疗或预防效果的剂量来供给人体或其他动物。本发明的这种化合物可以以一种常规剂量的形式供给这类人或其他动物，该化合物是通过使本发明的化合物和常规的医药上可接受的载体或稀释剂按照已知技术混合来制备的。本领域技术熟练人员都将认识到，医药上可接受的载体或稀释剂的形式和特点取决于活性成分和与之混合的物质的量、供给途径及其他众所周知的可变因素。
本发明化合物的供给途径可以是口服的、非经肠道的、通过吸入或局部的。这里所用术语“非经肠道的”包括静脉内的、肌内的、皮下的、直肠的、鞘的或腹膜内的供药。皮下的和肌内形式的非经肠道供药通常是优选的。
为了用本发明的化合物达到在预防或治疗上抑制致病真菌的生长、在预防或治疗上诱发免疫抑制、或治疗致癌肿瘤的目的，每天非经肠道的或口服的剂量规定通常在每千克体重约0.05-100毫克范围内，但优选约0.5-10毫克。
本发明的化合物也可以通过吸入法供给。通过“吸入法”意思是鼻内或口内吸入法供药。这种供药的适宜剂量形式，例如气雾剂制剂或计量剂量吸入器，可以用常规技术来制备。应采用的本发明化合物的优选剂量通常是在约10-100毫克范围内。
本发明的化合物还可以局部性地被供给。术语“局部性供给”意思是非全身的供给和包括将本发明的化合物外用于表皮、口腔前庭和将这种化合物滴注入耳朵、眼睛和鼻子、以及该化合物不能大量进入血流的地方。术语“全身供给”的意思是口的、静脉内的、腹膜内的和肌内的供给。当然，在致病真菌生长抑制或免疫抑制剂诱发方面有治疗或预防效果所需要的以局部性供给的本发明化合物的剂量(以下均指活性成分)将随着所选的化合物、所治疗的性质和条件的严重程度以及接受治疗的动物而变化，并最终由医生的酌定。本发明化合物适宜的局部剂量通常在每千克体重每天约1-100毫克范围内。
尽管活性成分能以原化学品形式单独供给，但是最好是以药物制剂形式存在。对于局部的给药来说，活性成分可以占0.001%-10%w/w，例如为制剂的1%-2%重量，尽管也可以多达10%，但优选的是不超过5%，更优选的是占制剂重量的0.1-1%w/w。
本发明的局部制剂，既可用于兽医也可用于人体治疗，它包含活性成分和一种或多种其可接受的载体并任选地包含任何其他治疗成分。载体必须是“可接受的”意思是与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害。
适于通过皮肤渗透到所需治疗部位的局部供给的制剂包括液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、霜剂、软膏或糊剂，以及适于供给眼睛、耳朵或鼻子的滴剂。
本发明的滴剂可以包含无菌的含水或含油的溶液或悬浮液，并且可以通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或其他适宜的防腐剂，并优选还包括一种表面活性剂的含水溶液中来制备。然后可将所得溶液用过滤法澄清，转移到一个适当的容器，然后密封并通过高压灭菌或在90-100℃下保持半小时来消毒。另一种可选择的方法是，溶液可通过过滤来消毒并用无菌技术转移到容器中。滴剂中适宜包括的杀菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)，灭藻铵(0.01%)和醋酸洗必太(0.01%)。适于制备含油溶液的溶剂包括丙三醇、稀醇和丙二醇。
本发明的洗剂包括那些适用于皮肤或眼睛的洗剂。洗眼剂可以包含一种任选地含有杀菌剂的无菌水溶液，并且可以用类似于制备滴剂的方法来制备。适用于皮肤的洗剂或搽剂还可以包含一种促进皮肤干燥和凉爽的试剂，例如乙醇或丙酮，和/或一种湿润剂例如丙三醇或油例如蓖麻油或花生油。
本发明的霜剂、软膏或糊剂是活性成分的供外用的半固体制剂。它们可以通过下述方法制备供助于适当的机械，将细粉碎的或粉末形式的活性成分单独地或在含水或不含水的液体中以溶液或悬浮液的形式与一种油脂的或非油脂的基料混合。该基料可以包括烃类，例如硬的、软的或液体的石蜡，丙三醇，蜂蜡，金属皂;胶浆;天然油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或椰榄油;羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸例如硬脂酸或油酸与醇例如丙二醇或聚乙二醇(macrogol)的混合物。该制剂可以混入任何适宜的表面活性剂，例如阴离子的、阳离子的或非离子的表面活性剂，例如脱水山梨(糖)醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以掺入悬浮剂例如天然胶、纤维素衍生物或有机材料例如硅胶，和其他成分例如羊毛脂。
本领域技术熟练人员将认识到本发明化合物的最佳剂量和各剂量的间隔时间将取决于治疗条件的性质和程度，供药的形式、途径和部位，以及被治疗的具体动物，并且该最佳值可通过常规方法来测定。本领域技术熟练人员还将认识到治疗的最佳过程，即对于规定天数的每天提供的本发明化合物的剂量数，可以由那些本领域的技术熟练人员用常规的治疗测定试验来确定。
无需赘述，相信本领域的技术熟练人员能够用前面的说明，将本发明实施到最充分的程度。因此，下列实施例仅被用来说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。
实施例Ⅰ、组合物实施例实施例A-胶囊组合物本发明以胶囊形式的药物组合物是通过将50毫克的粉末的形式的本发明化合物，100毫克的乳糖，32毫克的滑石粉和8毫克的硬脂酸镁填充在标准的两片硬质明胶胶囊中制备的。
实施例B-可注射的非经肠道的组合物本发明的适于用注射供给的药物组合物是通过在10%体积的丙二醇水溶液中搅拌1.5%重量的本发明化合物来制备的。该溶液通过过滤被消毒。
实施例C-软膏组合物本发明的化合物1.0克加白色软石蜡直100.0克将本发明的化合物分散在小体积的载体中，并逐渐加入大量的载体以形成一种光滑、均匀的制品。然后将此分散体填充到可折叠的金属管中。
实施例D-局部使用的霜剂组合物本发明的化合物1.0克Polawax GP 200 20.0克无水羊毛脂2.0克白色蜂蜡2.5克羟基苯甲酸甲酯0.1克加蒸馏水直到100.0克将polawax、蜂蜡和羊毛脂在60℃下一起加热。加入羟基苯甲酸甲酯溶液并通过高速搅拌实现均化。然后让温度降到50℃。再加入本发明的化合物并使其充分分散，在低速搅拌下将组合物冷却。
实施例E-表面洗剂组合物本发明的化合物1.0克脱水山梨(糖)醇单月桂酸酯0.6克多乙氧基醚200.6克十六醇十八醇混合物1.2克丙三醇6.0克羟基苯甲酸甲酯0.2克加纯化水(英国药典)直到100.00毫升将羟基苯甲酸甲酯和丙三醇溶解在75℃的70毫升水中。脱水山梨(糖)醇单月桂酸酯，多乙氧基醚20和十六醇十八醇混合物也在75℃下一起熔混并被加入到水溶液中。使所得的溶液均化，让其在连续搅拌下冷却，并在剩余的水中加入本发明的化合物成为悬浮液。搅拌整个悬浮液直到均化为止。
实施例F-滴眼剂组合物本发明的化合物0.5克羟基苯甲酸甲酯0.01克羟基苯甲酸丙酯0.04克加纯化水(英国药典)直到100.00毫升在75℃下将羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯溶解在70毫升的纯化水中，并将所得的溶液冷却。然后加入本发明的化合物，再通过膜过滤器(0.22微米孔径大小)进行过滤消毒并无菌装填在适当的无菌容器中。
实施例G-通过吸入法供药的组合物对于一个容量为15-20毫升的气雾剂容器将10毫克本发明的化合物与0.2-0.2%的润滑剂例如多乙氧基醚85或油酸一起混合，并将这种混合物分散在一种推进剂，例如氟里昂，优选为在一种(1，2-二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物中，然后放入一个适宜的气雾剂容器中，用于鼻内吸入或者口腔吸入来供药。
实施例H-通过吸入法供药的组合物对于一个容量为15-20毫升的气雾剂容器将10毫克本发明的化合物溶解在乙醇(6-8毫升)中，加入0.1-0.2%的润滑剂，例如多乙氧基醚85或油酸;并将这种混合物分散在一种推进剂，例如氟里昂，优选为在一种(1，2-二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物中，然后放入一个适宜的气雾剂容器中，用于鼻内吸入或者口腔吸入来供药。
Ⅱ.合成实施例在下列实施例中，雷帕霉素是通过发酵获得的，所有其他原料和化学试剂除非特殊声明外，都是从市场上买来的。
实施例1.43-脱羟基雷帕霉素(43-Deshydroxyrapamycin)[R1为(H，H)，R2为＝O，R3为H和R5为H]A.雷帕霉素苯硫羰碳酸酯(Phenylthionocarbonates)在冰浴和氩气氛下将雷帕霉素(80.5毫克，88.1摩尔)溶解在1.5毫升的无水二氯甲烷中。然后加入二甲氨基吡啶(80.0毫克，0.655毫摩尔)和苯硫羰甲酸酯(40.0微升，0.289毫摩尔)。将所得的桔黄色溶液搅拌4小时，其后用薄层色谱法(硅胶，35%乙酸乙酯/石油醚)进行分析表明除了存在少量的雷帕霉素外，还存在三种截然不同的产物。然后将反应混合物用1.0毫升的二氯甲烷稀释，并将此混合物直接加到含硅胶的快速色谱柱中。用25%乙酸乙酯/己烷洗脱产生28，43-双-硫羰碳酸酯雷帕霉素衍生物(28毫克，Rf＝0.82)和43-硫羰碳酸酯雷帕霉素衍生物(18.5毫克，Rf＝0.58)。继续用60%乙酸乙酯/己烷洗脱产生28-硫羰碳酸酯雷帕霉素衍生物(18.5毫克，Rf＝0.19)和残留的雷帕霉素(6毫克，Rf＝0.07)。
B.43-脱羟基雷帕霉素在0.2毫升的甲苯中，在室温和氩气氛下，将三乙基硼烷(15微升，1.0M己烷溶液)加入到正在搅拌的雷帕霉素-43-苯硫羰碳酸酯(10毫克，9.5摩尔)中(按照实施例1A中的描述制备)。加入三(三甲基甲硅基)硅烷(30微升，97微摩尔)并将所得溶液搅拌10分钟。然后再注入另外的10微升的三乙基硼烷溶液，并将此混合物暂时暴露在空气中。在总反应时间为30分钟后，用0.5毫升的甲苯将溶液稀释，并直接加入到快速色谱柱中。用25%乙酸乙酯/己烷洗脱产生1.5毫克的43-脱羟基雷帕霉素白色固体，熔点(m.p.97-100℃)。下面是对43-脱羟基雷帕霉素获得的核磁共振数据氢核 雷帕霉素 43-脱羟基雷帕霉素(TMS) (TMS)Me(46)O 3.41(s) 3.34(s)C(42)H 2.93(m) 3.07(m)实施例2.43-脱氢雷帕霉素(R′为＝O，R2为＝O，R3为H，和R5为H)在0℃下将雷帕霉素(109.7毫克0.12微摩尔)加入到在二氯甲烷(1.2毫升)中的含有过钌酸四丙基铵(8.4毫克，24微摩尔)，N-甲基吗啉氧化物(42.2毫克，0.36微摩尔)和4A分子筛(120毫克)的反应混合物中，共用3小时。反应的TLC(薄层色谱法)分析(硅胶，洗脱液是20∶80己烷/乙酸乙酯)表明有一些初始的未反应雷帕霉素。因此，加入额外量的过钌酸四丙基铵(8.4毫克，24微摩尔)和N-甲基吗啉氧化物(42.2毫克，0.36微摩尔)，并在0℃下再连续搅拌2小时以上。粗混合物(黑色悬浮液)用硅胶快速色谱法(梯度洗脱液是40∶60-20∶80的己烷/乙酸乙酯)提纯以产生55毫克(50%)的43-脱氢雷帕霉素白色粉末(在硅胶、20∶80己烷/乙酸乙酯中的Rf值43-脱氢雷帕霉素为0.45和雷帕霉素为0.30)。下面是对43-脱氢雷帕霉素所获得的核磁共振数据氢核 雷帕霉素 43-脱氢雷帕霉素(TMS) (TMS)Me(46)O 3.41(s) 3.36(s)C(42)H 2.93(m) 3.80(dd)实施例3.14-脱氧雷帕霉素[R1为(H，OH)，R2为(H，H)，R3为H和R5为H]在室温下使硫化氢呈泡状通过正在搅拌的在5毫升1∶1的甲醇-吡啶中的雷帕霉素(100毫克，0.109毫摩尔)溶液，为时1小时。然后将黄色反应混合物盖住并搅拌过夜。过量的硫化氢被稳定的氩气流驱散，其后在减压下除去溶剂。所得残留物用快速色谱分离(80%乙酸乙酯/己烷)产生标题化合物，即14-脱氧雷帕霉素，为白色固体，熔点106-109℃。下面是对14-脱氧雷帕霉素所获得的核磁共振数据氢核 雷帕霉素 14-脱氧雷帕霉素(TMS) (TMS)Me(16)H's N/A 2.42(d,J=15.3HzC(20)H 5.29 2.71(d,J=15.3Hz)实施例4.43-脱羟基-14-脱氧雷帕霉素[R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为H和R5为H]
将43-脱羟基雷帕霉素(100毫克)溶解在5毫升1∶1的甲醇和吡啶混合物中。向所得溶液中通1小时硫化氢。然后将反应混合物放置一天。过量的硫化氢被向溶液中鼓泡通过的氩气所驱散，溶液随后被浓缩。用乙酸乙酯-己烷混合物作为洗脱剂，使标题化合物通过硅胶上的柱色谱法而从残留物中分离出来。
实施例5.43-脱氢-14-脱氧雷帕霉素[R1为＝O，R2为(H，H)，R3为H和R5为H]将43-脱氢雷帕霉素(100毫克，实施例4)溶解在5毫升1∶1的甲醇和吡啶混合物中。向所得溶液通入1小时硫化氢。然后将反应混合物放置一天。过量的硫化氢被向溶液中鼓泡通过的氩气所驱散，随后溶液被浓缩。用乙酸乙酯-己烷混合物作为洗脱剂，将标题化合物通过硅胶上的柱色谱法而被从残留物中分离出来。
实施例6.43-脱羟基-14-脱氧-28-酸基雷帕霉素[R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为-C(O))R7，和R5为H]在冰浴中和氩气气氛下，将43-脱羟基-14-脱氧雷帕霉素(80毫克，实施例5)溶解在1.5毫升的无水二氯甲烷中。然后加入二甲氨基吡啶(80毫克)和烷基酰基氯[R7C(O)Cl，3毫摩尔)。将溶液搅拌4-12小时，其后反应混合物用1.0毫升二氯甲烷稀释并被直接加入到含硅胶的快速色谱柱中。用乙酸乙酯/己烷混合物洗脱产生标题化合物。
实施例7.43-脱羟基-28-酸基雷帕霉素[R1为(H，H)，R2为＝O，R3为C(O)R7和R5为H]
除了43-脱羟基-14-脱氧雷帕霉素用43-脱羟基雷帕霉素取代外，标题化合物是采用与43-脱羟基-14-脱氧-28-酸基雷帕霉素(实施例6)相同的步骤获得的。
实施例8.43-酰基-14-脱氧雷帕霉素[R1为(H，OC(O)R7)，R2为(H，H)，R3为H和R5为H]在冰浴中和氩气氛下，将14-脱氧雷帕霉素(80毫克，实施例3)溶解在1.5毫升的无水二氯甲烷中。然后加入二甲氨基吡啶(80毫克)和烷基酰基氯[R7C(O)Cl，3毫摩尔]。将溶液搅拌4～12小时，此后用1.0毫升二氯甲烷稀释反应混合物并将其直接加入到含硅胶的快速色谱柱中。用乙酸乙酯/己烷混合物洗脱产生标题化合物和28，43-双酰基化的14-脱氧雷帕霉素衍生物。
实施例9.13-烷氧基-14-脱氧雷帕霉素[R1为(H，OH)，R2为(H，H)，R3为H和R5为烷基]将14-脱氧雷帕霉素(80毫克，实施例3)溶解在2毫升的C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、丙醇)和催化量(2毫克)的樟脑磺酸中。将反应混合物在室温下搅拌一天，此后溶液被浓缩并且用柱色谱分离法将标题化合物从残留物中分离出来。
Ⅲ.生物试验例用下面的试验对本发明的化合物作抗菌和免疫抑制活性分析。
抗菌活性试验将以对数方式生长的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)涂敷在完整的琼脂介质(YPD)上。把溶解在适当水或有机溶剂中的化合物放入到穿透琼脂的孔中。将培养皿培育48小时并测量抑制区域的大小。所有经这项试验的本发明的化合物都显示出抗菌活性。
免疫抑制活性的有丝分裂试验在RPMI中用10%的胎牛血清以5×106/毫升植入从BDF1雌鼠身上分离出的脾细胞。将此悬浮液的100毫升(5×106细胞)等量分配在96-穴的圆底微滴度皿上(Linbro，Flow Laboratories)。加入作为有丝分裂刺激物的伴刀豆球蛋白A(5微克/毫升)，并将微滴度穴的最终体积用RPMI调整到200微升。在37℃下和5%的CO2气氛中将细胞培养物培育72小时，并在72小时培养的最后18小时加上0.5微居里3H-胸苷(比活性为2.00居里/摩尔)。在一台自动多样采集器上采集细胞并在贝克曼液体闪烁计数器中计算与细胞有关的放射活性。结果用以四份测量值的所得的平均值来表示。细胞存活力用72小时培育后的锥虫蓝排除法来测定。在加入细胞前，将要被试验的化合物加入到在适当稀释剂下的微滴度皿上。在这项试验中所有本发明的化合物都显示出免疫抑制活性。
这两项试验的结果，即本发明化合物的抗菌活性试验和免疫抑制活性的有丝分裂试验的结果被提供在表1中。
表1化合物活性化合物 酵母 有丝分裂IC12(毫微克/毫升) IC50(毫微摩尔浓度)43-脱羟基-雷帕霉素 8 0.5(实施例1)14-脱氧-雷帕霉素 13 15(实施例3)14-脱氧-13-甲氧 52 1000基-雷帕霉素虽然上述说明和实施例充分描述了本发明及其优选的实施方案，但应该理解本发明并不局限于属于权利要求范围内的特定公开的实施方案。
权利要求
1.一种化合物及其所有的药物上可接受的盐、水合物或溶剂化物，该化合物的通式如下
其中R1选自由=O、(-OR6，H)和(H，H)组成的组；R2选自由=O或(H，H)组成的组，前提条件是当R1为(-OR6，H)或=O时，R2为(H，H)；R3和R6均独立地选自由-H、-C(=O)R7、-C(=O)OR7、-C(=O)NHR7和-C(=S)OR7组成的组；R5选自由-H和C1-C4烷基组成的组；和R7选自由C1-C10烷基、C3-C6环烷基、芳基、和杂环基组成的组；前提条件是，当R1为=O时，则至少满足下列情况之一(a)R2不是=O，(b)R3不是H，和(c)R5不是H。
2.权利要求1的化合物，其中R1选自由(H，H)和(H，OH)组成的组。
3.权利要求1的化合物，其中R2为＝0。
4.权利要求1的化合物，其中R3为H。
5.权利要求1的化合物，其中R5为H。
6.权利要求1的化合物，其中(a)R1为(H，H)，R2为＝O，R3为-H和R5为-H;(b)R1为(H，OH)，R2为(H，H)，R3为-H和R5为-H;(c)R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为-H和R5为-H;(d)R1为＝O，R2为(H，H)，R3为-H和R5为H;(e)R1为(H，H)，R2为(H，H)，R3为-C(O)R6，和R5为-H;(f)R1为(H，H)，R2为＝O，R3为-C(O)R6，和R5为H;(g)R1为[H，OC(O)OR6]，R2为(H，H)，R3为-H和R5为-H;或者(h)R1为(H，OH)，R2为-H，R3为-H，和R5为C1-C4烷基。
7.一种药物组合物，它包含药物上可接受的载体或稀释剂，和有效的治疗或预防剂量的一种或多种权利要求1的化合物。
8.一种药物组合物，它包含药物上可接受的载体或稀释剂和有效的治疗或预防剂量的一种或多种权利要求2的化合物。
9.一种药物组合物，它包含一种药物上可接受的载体或稀释剂和有效的治疗或预防剂量的一种或多种权利要求3的化合物。
10.一种药物组合物，它包含药物上可接受的载体或稀释剂和有效的治疗或预防剂量的一种或多种权利要求4的化合物。
11.一种药物组合物，它包含药物上可接受的载体或稀释剂和有效的治疗或预防剂量的权利要求5的化合物。
12.一种药物组合物，它包含药物上可接受的载体或稀释剂和有效的治疗或预防剂量的权利要求6的化合物。
13.一种在需要抑制致病真菌生长的人或其他动物中抑制致病真菌生长的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的权利要求1的化合物。
14.一种在需要诱发免疫抑制的人或其他动物中诱发免疫抑制的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的权利要求1的化合物。
15.一种治疗人或其他动物中的致癌肿瘤的方法，它包括向这样的人或其他动物供给有效的、无毒剂量的权利要求1的化合物。
16.一种化合物，其通式如下
其中R′为-(S)COPh，此处Ph为苯基，R″选自由H和-(S)COPh组成的组，此处Ph为苯基，R2选自由＝O或(H，H)组成的组;和R5选自由-H和C1-C4烷基组成的组。
17.一种制备权利要求1的化合物的方法，包括将下列通式的化合物与一种自由基还原剂和一种自由基引发剂相接触，所说的通式为
式中R1为-(S)COPh，此处Ph为苯基，R″选自由H和-(S)COPh组成的组，此处Ph为苯基，R2选自由＝O或(H，H)组成的组;和R5选自由-H和C1-C4烷基组成的组。
18.权利要求17的方法，其中所述的自由基还原剂选自由氢化三烷基锡和三(三甲基甲硅烷基)硅烷组成的组，并且所述的自由基引发剂选自由偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰和三乙基甲硼烷组成的组。
全文摘要
雷帕霉素衍生物，包含这种雷帕霉素衍生物和药物上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，和使用这样的衍生物抑制致病真菌生长、诱发免疫抑制或治疗致癌肿瘤的方法。
文档编号A61P31/04GK1087912SQ93116589
公开日1994年6月15日 申请日期1993年7月17日 优先权日1992年7月17日
发明者D·A·霍尔特, 小·L·W·罗沙穆斯, J·I·卢恩戈 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司