专利名称：一种细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品，特别是涉及一种细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品，具体地说是以氯化钠晶体作为致孔剂得到一种细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料的方法及其制品。
背景技术：
组织工程是应用工程学和生命科学的原理与方法，将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架，细胞在支架上增殖、分化，构建生物替代物，然后将之移植到组织病损部位，达到修复、维持或改善损伤组织功能的一门科学。其核心内容是构建一个由细胞和生物材料组成的一个三维复合体(组织或器官)。目前随着组织工程的发展，作为组织工程三要素之一的生物支架材料越来越受到研究人员的重视，已经成为影响组织工程发展的最重要环节。组织工程支架材料为细胞、组织的重建提供了必要的三维空间和力学支持，起到模拟细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM)的作用。具有良好的组织相容性；生物可降解性和适合的降解率；适合的孔径和孔隙率，利于细胞的增殖和黏附，以及营养物质的渗入和细胞代谢产物的排出。组织工程支架材料的发展经历了从微米级支架，微米级纤维支架到纳米级纤维支架的过程。对于支架的构建应该在宏观、微观、纳观上同时进行。这是因为由胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、层连蛋白和弹性蛋白等组成的体内细胞外基质是三维纳米结构(50 500nm)，ECM中存在纳米尺度的孔、纤维和隆起。它不只具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，而且对细胞的基本生命活动发挥全方位的生物学作用。因此组织工程支架材料应该具有能够模拟细胞外基质的三维纳米结构。同时为了保证细胞的培养过程中能够进入材料内部，组织工程支架材料还应具有适合细胞增殖和黏附的微米级大孔(50 250 μ m)。细菌纤维素(Bacterial Cellulose, BC)作为一种优良的生物材料，具有其独特的物理、化学和机械性质BC的微纤丝束直径为3 4nm，而由微纤维束连接成的纤维丝带宽度为70 SOnm具有天然的三维纳米网络结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能，非凡的持水性和高湿强度。大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和良好的生物可降解性，极好的形状维持性能和形状可调控性。这使得细菌纤维素本身已经可以作为组成工程材料使用，但由于天然的细菌纤维素没有微米级大孔，细胞只能在表面黏附、增殖，不能进入材料内部。因此，制备出细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料对其在组织工程中的应用尤为重要。最近Backdahl分别使用淀粉、石蜡作为致孔剂在木醋杆菌在发酵时制备出具有一定孔径的三维组织工程细菌纤维素血管支架材料，材料孔径、厚度、连通性均可通过改变致孔剂的尺寸和发酵条件来控制，细菌纤维素良好的塑型性使得其作为组织工程支架时，可以更好的控制孔径与孔隙率以满足不同组织构建时的需要。但是存在的问题是，发酵时间较长，工艺较为复杂，并且难以完全去除支架材料中制孔剂。中国专利CN101288778A公布了一种采用冰晶作为致孔剂对发酵后的细菌纤维素进行处理制备出含有大孔的细菌纤维素组织工程支架材料的方法。但此方法在冷冻干燥时由于冰晶升华产生的大孔容易形成塌陷，造成材料结构的破坏。氯化钠晶体是一种安全、无毒的制孔剂材料，已广泛用于制备多孔组织工程支架材料。段志军等将氯化钠晶体颗粒加入到溶解度较小的聚乙烯醇的二甲基亚砜/水溶液中，均勻搅拌后迅速冷冻，并利用蒸馏水置换出凝胶中的溶剂和氯化钠颗粒，并得到具有三维多孔结构的聚乙烯醇支架材料。然而氯化钠晶体颗粒通常是均勻分散在未成型的原料中后才能制备多孔支架材料，而对于细菌纤维素膜是一种成型产品，若将其溶解或打浆会造成细菌纤维素膜力学性能满足不了支架材料的要求，氯化钠晶体颗粒则不能通过在溶解或打浆的细菌纤维素原料均勻分散后来制备多孔支架材料，因此需要寻求一种利用氯化钠晶体在已成型的细菌纤维素膜制备多孔支架材料的有效方法，并得到孔径可控的细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料。

发明内容
本发明的目的是提供一种细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品，本发明的方法在不溶解、打浆分散细菌纤维素膜的基础上，通过将氯化钠晶体作为致孔剂在成型的细菌纤维素膜上形成多孔结构，其制备过程简单易行、操作方便、无污染、成本低；通过简单控制氯化钠水溶液的浓度、冷冻温度、冷冻速率等条件可调控微米级大孔的孔径和分布，得到一种能够满足组织工程应用的细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料。本发明的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，将细菌纤维素膜浸泡在20 100°C的氯化钠水溶液中，静置或搅拌5 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，骤冷或逐步降温至-20 -196°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 250 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；所述氯化钠水溶液的质量百分比浓度为该温度条件下饱和氯化钠水溶液质量百分比浓度的30 100% ；由于氯化钠在水中的溶解度与水溶液温度有关，在某一温度下可配制的最高浓度为这一温度时氯化钠在水中的饱和浓度。氯化钠结晶时的晶体数量、晶粒粒径大小与氯化钠溶液的浓度、温度有关，从而影响了支架材料中大孔的孔径及分布，因此可以通过改变氯化钠溶液的浓度、温度控制细菌纤维素支架的结构。所述的骤冷是指在Imin内迅速将细菌纤维素膜降温至_20 _196°C。骤冷时，晶核迅速形成，晶粒来不及长大，因此形成的孔径较小。-196°C为液氮通常本身的温度。作为优选的技术方案其中，如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的氯化钠水溶液的溶剂为二次蒸馏水。如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的逐步降温方法为梯度降温法或勻速降温法，降温至-20 -196°C。
如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的梯度降温法是指按均等递降的温度梯度等级逐步降温的方法，逐步降温时在每个降温温度下保持10-20min ；所述的按均等递降的温度梯度等级是从浸泡温度20 100°C到冷却温度-20 -196°C之间选择2-5个均等递降的降温温度。如20°C到-20°C的4个均等递降的降温温度为10°C、 0°C、-IO0C、-20°C。在每个降温温度下保存10-20min。如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的勻速降温法是指按照一定的降温速率勻速下降温度的方法；所述的降温速率为1 20°C /min。如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的冷冻干燥时间为12 48h。如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的水洗为采用二次蒸馏水水洗，水洗温度为20 100°C，水洗时间为10 120分钟，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子。可利用氯离子与某些离子反应生成沉淀的特性检测有无氯离子。如利用银离子与氯离子反应生成氯化银沉淀来判定。如上所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，所述的细菌纤维素膜是由木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种产出的，经过分离提纯除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。分离提纯办法如将细菌纤维素膜浸泡在质量百分含量为1 8%的NaOH水溶液中，在60 100°C的温度下加热3 6h，再用二次蒸馏水反复冲洗至中性。本发明还提供了一种依据上述方法制得的细菌纤维素支架材料，细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 250 μ m大孔的细菌纤维素支架材料。其中，所述的细菌纤维素是由木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种产出的纤维素。有益效果与现有技术相比，本发明的优点是(1)不需要溶解、打浆分散细菌纤维素，就可将氯化钠晶体均勻分散在成型细菌纤维素膜上，并形成多孔支架材料。(2)细菌纤维素支架材料的制备过程不使用任何有毒溶剂，不会带来环境污染以及生态危机等问题，符合生物医学领域的使用要求。(3)以氯化钠作为主要的致孔剂，避免了冷冻干燥时由于冰晶升华产生的大孔塌陷现象，保证了支架材料在在宏观、微观、纳观上同时进行。(4)制备过程简单易行、操作方便、无污染、成本低；通过简单控制氯化钠水溶液的浓度、冷冻温度、冷冻速率等条件调控微米级大孔的孔径和分布，得到一种能够满足组织工程应用的细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1将细菌纤维素膜浸泡在20°C的40%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，在Imin中内骤冷降温至-20°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为20°C，水洗时间为30min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 70 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例2将细菌纤维素膜浸泡在50°C的60%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，在Imin中内骤冷降温至-80°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为30°C，水洗时间为50min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 100 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例3将细菌纤维素膜浸泡在80°C的80%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，在Imin中内骤冷降温至-120°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为60V，水洗时间为60min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 140 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例4将细菌纤维素膜浸泡在100°C的100%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，在Imin中内骤冷降温至-196°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为 100°C，水洗时间为120min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 180 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例5将细菌纤维素膜浸泡在20°C的80%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，逐步降温至_20°C，选择2个降温梯度温度为0°C、-20°C， 在每个降温温度下保存lOmin，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为30°C，水洗时间为30min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 90 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例6将细菌纤维素膜浸泡在50°C的80%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，骤冷降温至-40°C，选择3个降温梯度温度为 20°C、-IO0C, -40°C，在每个降温温度下保存15min，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为50°C，水洗时间为50min， 直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着 50 120 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例7
将细菌纤维素膜浸泡在80°C的80%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，骤冷降温至_80°C，选择4个降温梯度温度为40°C、 0°C、-40°C、-8(rC，在每个降温温度下保存18min，待材料温度平衡后移至下一温度，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为70°C，水洗时间为80min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 180 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例8将细菌纤维素膜浸泡在100°C的100%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，骤冷降温至-196°C，选择5个降温梯度温度为 40 0C >-20 0C >-80 0C >-140 0C >-196 0C，在每个降温温度下保存20min，待材料温度平衡后移至下一温度，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为100°C，水洗时间为120min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子， 即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 220 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例9将细菌纤维素膜浸泡在20°C的40%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，勻速降温速率为10°c /min，降至所需的冷却温度-20°c， 以待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为20°C，水洗时间为30min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 100 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例10将细菌纤维素膜浸泡在50°C的60%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌30min， 再将处理后的细菌纤维素膜取出，勻速降温速率为10°c /min，降至所需的冷却温度-80°c， 待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠， 水洗温度为50°C，水洗时间为50min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 150 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例11将细菌纤维素膜浸泡在80°C的80%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，勻速降温速率为10°C /min，降至所需的冷却温度-140°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为80°C，水洗时间为90min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 200 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；实施例12将细菌纤维素膜浸泡在100°C的100%的饱和氯化钠水溶液中，静置或搅拌 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，勻速降温速率为10°C /min，降至所需的冷却温度-196°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，随后经水洗去除氯化钠，水洗温度为100°C，水洗时间为120min，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 250 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；
权利要求
1.一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征是将细菌纤维素膜浸泡在20 100°C的氯化钠水溶液中，静置或搅拌5 30min，再将处理后的细菌纤维素膜取出，骤冷或逐步降温至-20 _196°C，待细菌纤维素膜冷冻成固态后冷冻干燥；随后经水洗去除氯化钠，即得到细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 250 μ m大孔的细菌纤维素支架材料；所述氯化钠水溶液的质量百分比浓度为该温度条件下饱和氯化钠水溶液质量百分比浓度的30 100% ；所述的骤冷是指在Imin内迅速将细菌纤维素膜降温至-20 _196°C。
2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的氯化钠水溶液的溶剂为二次蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的逐步降温的方法为梯度降温法或勻速降温法。
4.根据权利要求3所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的梯度降温法是指按均等递降的温度梯度等级逐步降温的方法，逐步降温时在每个降温温度下保持10-20min ；所述的按均等递降的温度梯度等级是从浸泡温度20 100°C到冷却温度-20 -196°C之间选择2-5个均等递降的降温温度。
5.根据权利要求3所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的勻速降温法是指按照一定的降温速率勻速下降温度的方法；所述的降温速率为1 20°C / min0
6.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥时间为12 48h。
7.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的水洗为采用二次蒸馏水水洗，水洗温度为20 100°C，水洗时间为10 120分钟，直至水洗后的溶液中不再出现氯离子。
8.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素支架材料的制备方法，其特征在于，所述的细菌纤维素膜是由木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、 气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种发酵产出的，并经过分离提纯除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。
9.根据权利要求1 8所述的制备方法所制得的一种细菌纤维素支架材料，其特征是 细菌纤维素纳米三维网络结构中均勻分布着50 250 μ m大孔的细菌纤维素支架材料。
10.根据权利要求9所述的一种细菌纤维素支架材料，其特征在于，所述的细菌纤维素是由木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种产出的纤维素。
全文摘要
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品，特别是涉及一种细菌纤维素纳米三维网络结构中均匀分布着微米级大孔的细菌纤维素支架材料的制备方法及其制品，具体地说是以氯化钠晶体作为致孔剂得到一种细菌纤维素纳米三维网络结构中均匀分布着50～250μm大孔的细菌纤维素支架材料的方法及其制品。本发明的方法在不溶解、打浆分散细菌纤维素膜的基础上，通过将氯化钠晶体作为致孔剂在成型的细菌纤维素膜上形成多孔结构来制备生物医用支架材料，其制备过程简单易行、操作方便、无污染、成本低。
文档编号A61L27/20GK102274549SQ20111019176
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月10日 优先权日2011年7月10日
发明者尹娜, 徐秋舒, 李喆, 杨敬轩, 欧阳炀, 洪枫, 王华平, 陈仕艳 申请人:东华大学