专利名称：用于从血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法；包含固定在固体基质上的碳水化合物的设备用于从哺乳动物血液中体外去除所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的用途，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力；对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力的碳水化合物在制备用于治疗由所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的设备中的用途，其中所述碳水化合物固定在固体基质上；和用于治疗患有由病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的哺乳动物受试者的方法。背景生物学

在长时间的进化过程中，很多病原微生物已学会了发现真核细胞表面的糖缀合物(glycoconjugate),即糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖(proteoglycan),将其作为细胞附着(cellattachment)的受体分子，以促进定植(colonization)和入侵过程。简言之，细菌、病毒、真菌和寄生虫表面称作粘附素(adhesin)的特定蛋白与糖缀合物的碳水化合物链相互作用，所述碳水化合物能使微生物定植于粘膜表面和组织损伤(tissue lesion)。唾液酸在病原体与宿主细胞结合中的作用已经报道了很多年。仅在最近，蛋白聚糖及其碳水化合物链(糖胺聚糖)显示出结合很多不同的病原体。通过用唾液酸酶和其它外切糖苷酶，或者用单层细胞上的糖胺聚糖(GAG)降解酶，去除这些各种糖缀合物的末端碳水化合物部分，证明这些结构是各种唾液酸粘附素和硫酸乙酰肝素结合蛋白(HeBPs)的受体分子。在Siiri Hirmo, Meeme Utt 和 Torkel WadstlOITl,Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry, Volumel2,包括 Proceedings fromthel7th International Lectin Meeting in ffiirzburg, 1997, edited by Edilbert vanDriessche, Sonia Beeckmans and Thorkild C.B0g-Hansen ,由 ΤΕΧΤ0Ρ, Lemchesvej 11，DK-2900Hellerup, Denmark, ISBN number87-984583-0_2 出版，这篇综述文章中总结了这些机制。在微生物感染过程中释放并激活炎症介质。这些所谓的“致炎细胞因子(proinflammatory cytokine) ”包括肿瘤坏死因子α和β (TNF- α和TNF-β)、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)。这些细胞因子是脓血症(s^sis)的炎症反应的一部分。由脓血症导致的多器官衰竭现在是重病监护病房(intensive care unit)中死亡的主要因素。
与微生物感染和心血管外科手术(例如心肺转流术(cardiopulmonary bypass))相关，会引起炎症响应，并产生很多生物学后果，从亚临床器官功能障碍到严重的多器官衰竭。细胞因子被认为是这种响应中重要的调节子。上面提到的细胞因子具有与一些糖胺聚糖或GAG选择性结合的能力，所述糖胺聚糖包括组织中和内皮细胞与白细胞表面上的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)。受体硫酸乙酰肝素是存在于几乎所有哺乳动物细胞表面的糖胺聚糖。通过交替的(alternating) D-葡萄糖胺和糖醛酸残基(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)构建硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素是高荷电的(highly charged)(硫酸化)的异源多糖，并代表细胞表面上很多糖缀合物(多配体聚糖(syndecan)、基底膜蛋白多糖(perlecan)、磷脂酰肌醇聚糖(glypican))的碳水化合物部分。很多微生物利用哺乳动物细胞表面上的硫酸乙酰肝素作为受体。这种机制对于几乎所有细菌、病毒和寄生虫是通用和有效的。一些微生物使用不止一种糖缀合物受体。可以与硫酸乙酰肝素一起使用的其它受体的实例是特定的硫酸软骨素和包含糖蛋白的唾液酸。通过下述示例性说明结合硫酸乙酰肝素/硫酸软骨素的微生物:病毒，如单纯疱疫病毒 I 型(herpes simplex virus type I) (HSV-1), 口唇疱疫(orolabial herpes)的成因剂(causative agent);单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，生殖器疱疹的成因剂；细胞巨化病毒(cytomegalovirus) (CMV),使免疫抑制病人中的主要并发剂(complicatingagent);登革热病毒(dengue virus),其导致反复发热；和人免疫缺陷病毒(HIV);和细菌，如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia cil i)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis);和寄生虫，如恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)(导致痕疾(malaria)),和克氏维虫(Trypanosoma cruzi)(导致维虫病(Trypanosomiasis))。另外，细胞因子(cytokine),如TNF-β ,也使用细胞表面上的硫酸乙酰肝素来结合和激活。肝素作为受体肝素是多糖，其分离自哺乳动物组织。自从由美国科学家McLean于1916年发现以来，已经确认肝素的抗凝血剂(blood anticoagulant)性质,而且肝素在临床上用作抗凝血剂和抗血栓形成剂(antithrombotic agent)已经超过了 50年。硫酸乙酰肝素是所有由组织构成的动物生命形式中普遍存在的组分，而肝素在哺乳动物组织中有非常特定的分布。与硫酸乙酰肝素相反，肝素只存在于肥大细胞(mastcell)的嗜碱颗粒中。然而，今天，除了已确定具有预防和治疗血栓栓塞的作用之外，已经证明肝素具有独立于抗凝血的广谱的不同活性。血液中大量的蛋白与肝素和/或硫酸乙酰肝素以高的亲和力结合。实例是抗凝血酶(anti thrombin) (AT)、纤连蛋白(fibronectin)、玻璃粘连蛋白(vitronectin)和生长因子(growth factor)(例如成纤维细胞(fibroblast)生长因子、胰岛素样生长因子等)。人血清白蛋白(HSA)也可以结合，但亲和力较低。另一方面，血液中存在大量的HSA。为了使用肝素的这些性质来阻止感染，预期将肝素片段和/或包含唾液酸的片段(sialic containing fragment)引入血管系统。因此,认为这些片段将结合微生物上的凝集素，阻断凝集素并由此阻碍其与哺乳动物细胞表面上的受体结合。很多科学家尝试了这个概念，但是成功有限，在大多数情况中是因为将大量肝素引入血管系统时的出血并发症。US6, 197，568 公开了基于虫媒病毒(fIaviviruse)和出血热病毒(hemorrhagicfever virus)的硫酸化聚阴离子依赖性相互作用，用于分离和检测虫媒病毒和其它出血热病毒(如登革热病毒)的方法。可以在各种临床情况，包括肾透析、心肺转流术和血浆去除术中使用体外设备。“体外治疗”指可以向体液中加入如氧气、抗凝血剂、麻醉剂等期望产物的过程。反之，可以在体外从体液中去除不期望的产物，如毒素等。实例是血液透析(haemodialysis)和血液过滤(hemofiltration)，其代表从废产物中漂洗血液的技术。发明概述本发明的目的是提供通过从患有疾病或病症的哺乳动物血液中去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质来治疗所述哺乳动物方法，所述疾病或病症由不同的病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重。本发明的另一个目的是提供从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法。研究了下面的描述后，上述目的以及本发明的其它目的，对于本领域的技术人员是显而易见的，所述目的通过本文所述的本发明的不同方面来实现。本发明的第一方面提供从哺乳 动物血液体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法，其包含步骤:a)提供哺乳动物血液的样品，b)在允许血液样品中的任何病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质与碳水化合物结合的条件下，使所述样品与固定于固体基质上的碳水化合物接触，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力，c)从固体基质分离样品，使所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质至少部分保留于所述底物上，和d)回收所述样品，其包含的所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的量降低。具体地，本发明涉及如下各项:1.用于从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法，其包含步骤:a)提供哺乳动物血液的样品，b)在允许所述血液样品中的任何病原微生物、炎性细胞和炎性蛋白质与碳水化合物结合的条件下，使所述样品与固定在固体基质上的碳水化合物接触，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力，c)从固体基质分离样品，使所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质至少部分地保留在固体基质上，和d)回收所述样品，其包含的所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的量减少。2.根据项I的方法，其中所述病原微生物选自下组:细菌、病毒和寄生虫。3.根据项1-2中任一项的方法，其中所述病原微生物是病毒。
4.根据项3的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。5.根据项4的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒2型。6.根据项1-2中任一项的方法，其中所述病原微生物是细菌。7.根据项6的方法，其中所述细菌选自下组:幽门螺杆菌、血链球菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌。8.根据项6的方法，其中所述细菌是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。9.根据项I至2中任一项的方法，其中所述病原微生物是寄生虫。10.根据项9的方法，其中所述寄生虫选自下组:恶性疟原虫和克氏锥虫。11.根据任一项前述项的方法，其中所述炎性细胞选自下组:炎性淋巴细胞和炎性巨噬细胞。12.根据任一项前述项的方法，其中所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。13.根据项12的方法，其中所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β )、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素_6 (IL-6)。14.根据任一项前述项的方法，其中所述哺乳动物血液是人血液。15.根据任一项前述项的方法，其中所述碳水化合物选自下组:肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、包含唾液酸 的碳水化合物和包含神经氨酸的碳水化合物。16.根据项15的方法，其中所述碳水化合物是肝素。17.根据任一项前述项的方法，其中所述固体基质包含微粒。18.根据任一项前述项的方法，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。19.根据任一项前述项的方法，其中所述固体基质的材料选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机硅、特氟隆和聚氨酯。20.根据任一项前述项的方法，其中所述碳水化合物共价结合于所述固体基质。21.根据任一项前述项的方法，其中所述碳水化合物通过共价端点附接结合于所述固体基质。22.包含固定于固体基质上的碳水化合物的设备用于从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的用途，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力。23.对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力的碳水化合物在制备用于治疗由病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的设备中的用途，其中将所述碳水化合物固定于固体基质上。24.根据项22-23中任一项的用途，其中所述病原微生物选自下组:细菌、病毒和寄生虫。25.根据项24的用途，其中所述病原微生物是病毒。26.根据项25的用途，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。27.根据项26的用途，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒2型。28.根据项24的用途，其中所述病原微生物是细菌。29.根据项28的用途，其中所述细菌选自下组:幽门螺杆菌、血链球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌。30.根据项29的用途，其中所述细菌是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。31.根据项24的用途，其中所述病原微生物是寄生虫。32.根据项31的用途，其中所述寄生虫选自下组:恶性疟原虫和克氏锥虫。33.根据项22-32中任一项的用途，其中所述炎性细胞选自下组:炎性淋巴细胞和炎性巨噬细胞。34.根据项22-32中任一项的用途，其中所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。35.根据项34的用途，其中所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β )、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素_6 (IL-6)。36.根据项22-35中任一项的用途，其中所述哺乳动物血液是人血液。37.根据项22-36中任一项的用途，其中所述碳水化合物选自下组:肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、包含唾液酸的碳水化合物和包含神经氨酸的碳水化合物。38.根据项37的用途，其中所述碳水化合物是肝素。39.根据项 22-38中任一项的用途，其中所述固体基质包含微粒。40.根据项22-39中任一项的用途，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。41.根据项22-40中任一项的用途，其中所述固体基质选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机硅、特氟隆和聚氨酯。42.治疗哺乳动物受试者的方法,所述哺乳动物受试者患有由病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症，所述方法包含步骤:a)从受试者提取血液，b)在允许病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质与碳水化合物结合的条件下，使提取的血液与包含固定于固体基质上的碳水化合物的设备接触，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力，和c)将血液重新引入受试者的血流，所述血液中包含的所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的量减少。43.根据项42的方法，其中以连续循环的方式进行血液的提取和重新引入，所述循环包含受试者的部分血流。44.根据项42-43中任一项的方法，其中所述病原微生物选自下组:细菌、病毒和寄生虫。45.根据项44的方法，其中所述病原微生物是病毒。46.根据项45的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。47.根据项46的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒2型。48.根据项44的方法，其中所述病原微生物是细菌。
49.根据项48的方法，其中所述细菌选自下组:幽门螺杆菌、血链球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌。50.根据项49的方法，其中所述细菌是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。51.根据项44的方法，其中所述病原微生物是寄生虫。52.根据项51的方法，其中所述寄生虫选自下组:恶性疟原虫和克氏锥虫。53.根据项42-52中任一项的方法，其中所述炎性细胞选自下组:炎性淋巴细胞和炎性巨噬细胞。54.根据项42-53中任一项的方法，其中所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。55.根据项54的方法，其中所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β )、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素_6 (IL-6)。56.根据项42-55中任一项的方法，其中所述碳水化合物选自下组:肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素，以及包含唾液酸的碳水化合物和包含神经氨酸的碳水化合物。57.根据项56的方法，其中所述碳水化合物是肝素。58.根据项42-57中任一项的方法，其中所述固体基质包含微粒。59.根据项42-58中任一项的方法，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。60.根 据项42-59中任一项的方法，其中所述固体基质选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机硅、特氟隆和聚氨酯。发明详述将肝素片段和/或包含唾液酸的片段引入病人的血管系统，这个现有技术概念已经显示了有限的成功，在大多数情况下是因为将大量肝素引入血管系统时的出血并发症。根据本发明的方法通过固定于固体表面上的碳水化合物避免了这些问题，尤其如制备实施例6中所述。使用如通过本发明的方法定义的固定化碳水化合物还提供了更意想不到的优势。发明人已经发现，必须将碳水化合物固定在固体表面上，使其具有结合大量待去除的化合物所必需的能力。HSV-1的实施例1和比较实施例1中描述了这种意想不到的性质，其显示在溶液中，少于3%的病毒与过量肝素结合(比较实施例1)，而超过94%的病毒与固定化的肝素结合(实施例1)。本发明的方法通过从病人血流中去除导致病症的病原，能够对患有脓血症和脓血性休克的病人进行安全有效的治疗。本发明的方法允许去除很多不同的病原微生物、炎性细胞和炎性蛋白质。可以使用本发明的方法去除的通常与脓血症有关的病原微生物的实例包括葡萄球菌属，比如金黄色葡萄球菌，链球菌属和大肠杆菌。因为肝素和硫酸乙酰肝素都结合于大量组分，如背景部分例示的，所以期望的是当接触血液时用这些蛋白中的多种覆盖肝素表面，从而防止微生物附着。本发明的发明人令人惊讶地发现，使用根据本发明的方法和设备，可以实现从哺乳动物(包括人)高效地纯化血清和全血。本文公开了使用中等大小的柱，以从血清和全血中几乎完全去除相当量的病毒。参见例如实施例2、3和4。在实施方案中，所述病原微生物选自下组:细菌、病毒和寄生虫。在实施方案中，所述病原微生物是病毒。在更具体的实施方案中，所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒(influenza A virus)、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。在另一个更具体的实施方案中，所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒2型。在另一个实施方案中，所述病原微生物是细菌。在更具体的实施方案中，所述细菌选自下组:幽门螺杆菌、血链球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌。在优选实施方案中，所述病原微生物是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。在另一个实施方案中，所述病原微生物是寄生虫。在更具体的实施方案中，所述寄生虫选自下组:恶性疟原虫和克氏锥虫。在又一个的实施方案中，所述炎性细胞选自下组:炎性淋巴细胞和炎性巨噬细胞。在又一个的实施方案中，所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。在更具体的实施方案中，所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β)、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素-6(IL_6)。在实施方案中，所述哺乳动物血液是人血。在本发明方法的实施方案中，所述碳水化合物选自下组:肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、包含唾液酸(sialic acid)的碳水化合物和包含神经氨酸(neuramic acid)的碳水化合物。在更具体的实施方案中，所述碳水化合物是肝素。在另一个实施方案中，所述固体基质包含微粒或中空纤维。在本发明的一些实施方案中，所述固体基质的材料选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机娃(silicone)、特氟隆(Teflon)和聚氨酯。在又一个实施方案中， 所述碳水化合物与所述固体基质共价结合。在更具体的实施方案中，所述碳水化合物通过共价端点附接(covalent end-point attachment)结合于所述固体基质。与非共价附接相比，碳水化合物与固体基质的共价附接提供对参数(如固定化分子的表面密度和取向)的较好控制。发明人已经显示，这些参数对于提供病原与固定化碳水化合物分子的最优结合是重要的。固体基质上碳水化合物的表面浓度应该优选为l-10yg/cm2的范围。共价端点附接指碳水化合物经由碳水化合物分子的末端残基共价附接于固体基质。本发明的第二方面提供包含固定在固体基质上的碳水化合物的设备用于从哺乳动物血液中体外去除所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的用途，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力。根据本发明第二方面的用途的实施方案对应于上面详明的根据本发明的第一方面的方法的关于病原微生物、炎性细胞、炎性蛋白质、哺乳动物血液、碳水化合物、固体基质和固定化的那些实施方案。第三方面，本发明提供对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力的碳水化合物在制备用于治疗由所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的设备中的用途，其中所述碳水化合物固定在固体基质上。根据本发明第三方面的用途的实施方案对应于上面详明的根据本发明的第一方面的方法的关于病原微生物、炎性细胞、炎性蛋白质、哺乳动物血液、碳水化合物、固体基质和固定化的那些实施方案。在根据本发明的用途和方法中所指的设备可以包含用于体外处理病人(例如患肾衰竭的病人)的血液和血清的常规设备。已知在接触体外循环医疗设备的血液中的局部血流型态(local blood flowpattern)通过停滞区(stagnant zone)中血小板聚集(aggregation)和剪切活化(shearactivation)来影响血块的形成。因此，应该以不产生这些问题的方式设计本发明的第二、第三和第四方面所用的设备。在本发明的一些实施方案中使用的设备可以具有例如下述的性质:一血流为 l-500ml/min 的范围，优选 5_250ml/min。—流动阻力低。一其上固定有碳水化合物的基质具有大的表面积，例如约0.1-lm2。一稳定涂层(不向其接触的血液泄漏碳水化合物)。一在设备中具有适当的血液动力学性能(没有停滞区)。一最优的生物相容性。这种设备可以用于根据本发明的用途或方法中，其非限制性实例是儿科血流透析器(pediatric haemoflow dialyzer),比如 Gambro AB, Sweden 的 Prisma MlO 血过滤器 /透析器。还可以使用其它型号或类型的用于体外处理血液或血清的设备。本发明的第四方面提供治疗患有由病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的哺乳动物受试者的方法，所述方法包含步骤:a)从受试者提取血液，

b)在允许病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质与碳水化合物结合的条件下，使提取的血液接触包含固定于固体基质上的碳水化合物的设备，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力，和c)将血液重新引入受试者的血流中，所述血液包含的所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的量降低。在根据本发明的处理方法的实施方案中，血液的提取和重新引入以连续循环(continuous loop)的方式进行,所述循环包含受试者血流的一部分。根据本发明第四方面的治疗方法的实施方案对应于上面详明的根据本发明的第一方面的方法的关于病原微生物、炎性细胞、炎性蛋白质、哺乳动物血液、碳水化合物、固体基质和固定化的那些实施方案。如本文所使用的，术语“病原微生物”指微生物，将其引入生物体时，能在所述活的生物体中引起疾病。“病原微生物”的实例包括细菌、病毒和寄生虫。如本文所使用的，术语“炎性细胞”指细胞，其与哺乳动物中的炎症响应有关。“炎性细胞”的实例包括炎性淋巴细胞和炎性巨噬细胞。如本文所使用的，术语“炎性蛋白质”指蛋白质，如细胞因子，例如与微生物感染或免疫有关而释放的细胞因子。如本文所使用的，术语“细胞因子”指蛋白质，例如与微生物感染或免疫有关而释放的蛋白质，其选自下组:白细胞介素、干扰素、趋化因子和肿瘤坏死因子。
实施例制备实施例1
Sephadex G25 的胺化(amination)将高碘酸钠(sodiummetaperiodate) (NaIO4, 6.0g)溶于水(994ml)中，并加至
11水中的 Sephadex G25 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) (50g)。将混合物在黑暗中保持振荡24小时。在过滤和用5X11水与最终0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤后，将得到的产物悬浮于磷酸盐缓冲液，pH7.0 (350ml)中，并加入聚乙烯亚胺(polyethylenimine)的溶液(100ml Lupasol (BASF, Germany),在水中浓度为5%)。通过加入NaBH3CN即氰基硼氢化钠的水溶液(100ml中0.5g，磷酸盐缓冲液，0.1M，pH7.0)将凝胶稳定化。将所述凝胶过滤并如上所述洗漆，最后用乙酸盐缓冲液(500ml,0.1Μ,ρΗ4.0)洗漆,产生胺化的SephadexG25(85g)。制各实施例2肝素共价端点附接于色谱凝胶(chromatographic gel)上将如制备实施例1中所述获得的胺化的S印hadex G25 (85g)悬浮于乙酸盐缓冲液(800ml,0.1Μ,ρΗ4.0)中，并加入4.0g亚硝酸降解的肝素(Pharmacia, Sweden的肝素)。振荡0.5小时后，加入NaBH3CN(0.4g)。将反应混合物振荡24小时，然后如上所述进行处理，得到肝素化 Sephadex G25 (80g)。凝胶包含2%肝素(w/w,硫分析)。Sephadex G25珠的平均直径为50-150 μ m。粗略的计算显示Icm3包含IO6个珠子，得到珠的表面积为0.03m2/cm3。此外，如果肝素仅附接于珠子的表面，贝1J具有2%肝素w/w的肝素化Sephadex G25具有大约0.003 μ g肝素/cm2。制各实施例3将肝素共价附接于胺化玻璃丝(glass wool)上使用下述常用方法将玻璃丝材料肝素化。用酸(HCl)彻底清洗玻璃丝，用无水乙醇冲洗，在烘箱中在100°C干燥4小时。通过用聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)或壳聚糖的水溶液处理，将反应性氨基官能引至玻璃丝表面上。出于某些目的，可以通过与具有双官能试剂(如巴豆醛或戊二醛)交联将聚胺稳定于表面上。通过与硫酸化的多糖(硫酸葡聚糖或肝素)进行离子交联，进一步稳定涂层。如果需要的话，重复这些步骤并建立夹层结构(sandwich structure)。每步之间应该进行仔细的冲洗(水，合适的缓冲液)。在最后加入PEI或壳聚糖后，通过还原性的胺化，使用天然肝素的还原末端残基中的醛官能，使天然肝素的胺化表面进行末端附接。基本上如制备实施例2中所述，通过还原性胺化(氰基硼氢化物CNBH3_)在水溶液中进行偶连。如制备实施例2中所述的表面分析显示，约10mg/cm2的肝素与玻璃表面偶连。制各实施例4肝素共价附接于胺化的聚合物表面上使用下面所述的常用步骤将聚合物表面肝素化。用氧化剂(高猛酸钾、过氧化硫酸铵(ammoniumperoxidisulfate))侵蚀聚合物表面，以引入亲水特征连同一些反应性官 能团(_S03H、-0H、-C=0、-C=C-)。表面也可以用等离子体或电晕侵蚀。通过用聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)或壳聚糖处理来引入反应性氨基官能。出于某些目的，可以通过与双官能试剂(如巴豆醛或戊二醛)交联，将聚胺稳定于表面上。
可以通过与硫酸化的多糖(硫酸葡聚糖或肝素)进行离子交联，进一步稳定涂层。如果需要的话，重复这些步骤并建立夹层结构。每步之间应该进行仔细的冲洗(水，合适的缓冲液)。在最后加入PEI或壳聚糖后，通过还原性的胺化，使用天然肝素的还原末端残基中的醛官能，使天然肝素的胺化表面进行末端附接(EPA)。通过肝素的部分亚硝酸降解(nitrous degradation),可以在还原末端残基中获得反应性更好的醒官能。这缩短了反应时间，但是固定化的肝素的分子量更小。基本上如制备实施例2中所述，通过还原性胺化(氰基硼氢化物CNBH3-)在水溶液中进行偶连。l-10yg/cm2的肝素可偶连于所有亲水表面，如玻璃、纤维素、壳多糖等，和大约所有疏水性聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、PTFE等。制各实施例5肝素共价单点或多点附接于聚合物表面上如制备实施例2中所述进行，只是通过在水溶液中用高碘酸钠氧化，将醛官能引入肝素链中。制各实施例6将肝素附接于中空纤维的内腔上在这个制备实施例中，使用儿科血流透析器(pediatric haemoflow dialyzer)。透析器的纤维由聚砜制成，内径200微米，壁厚40微米。血液接触材料的总表面积为4000cm2,而预充容量(priming volume)为 28ml。如制备实施例4中的一般描述进行胺化过程，只是省略了侵蚀步骤。聚砜是亲水的，不需要侵蚀。如制备实施例2所述，通过泵送包含亚硝酸降解的肝素(来自Pharmacia的肝素)与NaBH3CN的溶液，进行肝素的固定化。因为对肝素量的测量是破坏性步骤，所以牺牲了在同样条件肝素化的参照透析器，将其纤维进行硫分析。结果显示，肝素含量为约5 μ g肝素/cm2，其对应于设备中20mg肝素的含量。制各实施例7带有末端唾液酸残基的寡聚物共价附接于中空纤维的内腔上在这个制备实施例中，使用还原性末端残基上的醛基进行偶连。如制备实施例6中所述进行纤维的胺化，并通过将式I的化合物(其与NaBH3CN(0.4g) 一起溶于乙酸缓冲液(800ml,0.1Μ，ρΗ4.0)中)在室温循环24小时，来进行式I的寡糖的偶连，所述寡糖包含末端唾液酸残基。结果显示唾液酸的含量为约2 μ g/cm2。
权利要求
1.用于从哺乳动物全血中体外去除病原微生物或炎性蛋白质的方法，其包含步骤: a)提供哺乳动物全血的样品， b)在允许所述血液样品中的任何病原微生物和炎性蛋白质与肝素结合的条件下，使所述样品与固定在固体基质上的肝素接触，所述肝素通过共价端点附接结合于所述固体基质，且所述肝素对于病原微生物或炎性蛋白质具有结合亲和力， c)从固体基质分离样品，使得所述病原微生物或炎性蛋白质至少部分地保留在所述固体基质上，和 d)回收所述样品，其包含的所述病原微生物或炎性蛋白质的量减少。
2.根据权利要求1的方法，其中所述病原微生物选自下组:细菌和病毒。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述病原微生物是病毒。
4.根据权利要求3的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。
5.根据权利要求4的方法，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒2型。
6.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述病原微生物是细菌。
7.根据权利要求6的方法，其中所述细菌选自下组:幽门螺杆菌(HeIicobacterpylori)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas auregin osa)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
8.根据权利要求7的方法，其中所述细菌是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。
9.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β )、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素_6 (IL-6)。
11.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述哺乳动物全血是人全血。
12.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述固体基质包含微粒。
13.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。
14.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述固体基质的材料选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机硅、特氟隆和聚氨酯。
15.根据任一项前述权利要求的方法，其中所述肝素共价结合于所述固体基质。
16.包含固定于固体基质上的肝素的设备用于从哺乳动物全血中体外去除病原微生物或炎性蛋白质的用途，所述肝素通过共价端点附接结合于所述固体基质，且所述肝素对于病原微生物或炎性蛋白质具有结合亲和力。
17.对于病原微生物或炎性蛋白质具有结合亲和力的肝素在制备用于治疗由病原微生物或炎性蛋白质引起或加重的病症的设备中的用途，其中将所述肝素通过共价端点附接结合固定于固体基质上。
18.根据权利要求16-17中任一项的用途，其中所述病原微生物选自下组:细菌和病毒。
19.根据权利要求18的用途，其中所述病原微生物是病毒。
20.根据权利要求19的用途，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、A型流感病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。
21.根据权利要求20的用途，其中所述病毒选自下组:单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒2型。
22.根据权利要求18的用途，其中所述病原微生物是细菌。
23.根据权利要求22的用途，其中所述细菌选自下组:幽门螺杆菌、血链球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌。
24.根据权利要求23的用途，其中所述细菌是幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌。
25.根据权利要求16-24中任一项的用途，其中所述炎性蛋白质是致炎细胞因子。
26.根据权利要求25的用途，其中所述致炎细胞因子选自下组:肿瘤坏死因子α (TNF-α)、肿瘤坏死因子β (TNF-β )、白细胞介素-1 (IL-1)和白细胞介素_6 (IL-6)。
27.根据权利要求16-26中任一项的用途，其中所述哺乳动物全血是人全血。
28.根据权利要求16-27中任一项的用途，其中所述固体基质包含微粒。
29.根据权利要求16-28中任一项的用途，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。
30.根据权利要求16-29中任一项的用途，其中所述固体基质选自下组:玻璃、纤维素、醋酸纤维素、壳多糖、壳聚糖、交联的葡聚糖、交联的琼脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有机硅、特氟隆和聚氨酯。
全文摘要
本发明涉及用于从血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法。具体地，本发明涉及从哺乳动物血液中体外去除病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的方法/包含固定在固体基质上的碳水化合物的设备用于从哺乳动物血液中体外去除所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质的用途，所述碳水化合物对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力/对于病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质具有结合亲和力的碳水化合物在制备用于治疗由所述病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的设备中的用途，其中所述碳水化合物固定在固体基质上/和用于治疗患有由病原微生物、炎性细胞或炎性蛋白质引起或加重的病症的哺乳动物受试者的方法。
文档编号A61M1/36GK103203048SQ20131009114
公开日2013年7月17日 申请日期2006年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者奥尔·拉姆, 托马斯·伯格斯特罗姆 申请人:埃克塞拉医学有限责任公司